王明洋 孫爭宇 張 麗 李雅莉 李 林 張 蘭

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥學(xué)部 北京市神經(jīng)藥物工程技術(shù)研究中心 北京腦重大疾病研究院 神經(jīng)變性病教育部重點實驗室，北京 100053)

2019年最新中國疾病負(fù)擔(dān)報告[1]顯示，腦卒中已經(jīng)成為2017年中國居民健康的頭號殺手，也是中國疾病負(fù)擔(dān)的第一原因。缺血性卒中是腦卒中最普遍最常見的一種，其首要治療方法是靜脈溶栓，但溶栓后極易引起的再灌注損傷可能促進(jìn)后遺癥的形成，嚴(yán)重影響疾病預(yù)后[2]。腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生的機制較為復(fù)雜，研究[3]顯示線粒體功能障礙在其中發(fā)揮重要作用。作為細(xì)胞的產(chǎn)能中心，線粒體損傷可引發(fā)系列病理變化，而功能障礙的線粒體在再灌注期間繼續(xù)產(chǎn)生大量活性氧自由基，加重過氧化反應(yīng)，形成惡性循環(huán)，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞代謝障礙，最終走向死亡[4]。因此調(diào)控并維持線粒體網(wǎng)絡(luò)的完整性及正常功能對細(xì)胞存活至關(guān)重要[5]。

山茱萸環(huán)烯醚萜苷(cornel iridoid glycoside，CIG)是傳統(tǒng)中藥山茱萸的主要有效成分，山茱萸具有補益肝腎，澀精固脫的作用，也可用于脫證的急救[6]。現(xiàn)代藥理研究[7]顯示，山茱萸具有抗休克、調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗氧化、抗衰老等作用。本課題組[8-10]前期研究顯示CIG對多種退行性、缺血性及創(chuàng)傷性腦損傷動物模型均有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用，但其具體作用機制尚未完全闡明。本研究通過觀察CIG對于大腦中動脈梗阻(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型大鼠神經(jīng)功能的改善作用及其對線粒體損傷的影響，為將其開發(fā)為安全有效的治療腦缺血的神經(jīng)保護(hù)藥物提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

CIG由首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥物研究室自行研制。山茱萸為市售(產(chǎn)地：浙江)，經(jīng)水提、醇沉、大孔吸附樹脂層析，提取和分離獲得CIG，純度為 71% (其中主要成分為莫諾苷和馬錢苷)。達(dá)到國家中藥、天然藥物5類新藥的要求。 CIG為棕黃色粉末，水溶性好。實驗中采用干粉劑量，溶解于蒸餾水，制成藥液應(yīng)用。

蛋白酶磷酸酶抑制劑、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)、放射免疫沉淀法(radio immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)定量檢測試劑盒等購于碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗PGC-1α抗體購于美國Abcam公司；兔抗DRP1、兔抗OPA1、兔抗NIX、兔抗Beclin1等抗體購于美國CST公司；β-actin抗體購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購于德國Millipore公司。其他Western blotting相關(guān)試劑購于北京普利萊技術(shù)有限公司。

1.2 實驗動物及分組

健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量260～280 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0006。飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院動物實驗室SPF級實驗動物房。采用數(shù)字表法將動物隨機分為5組：假手術(shù)(Sham)組，模型(MCAO)組，60 mg/kg CIG給藥組，120 mg/kg CIG給藥組，陽性藥銀杏葉片組(extract of Ginkgo biloba, EGB，12 mg/kg)，每組6只大鼠。各組大鼠于缺血再灌注6 h后開始灌胃給藥，其中假手術(shù)組和模型組大鼠給予0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液(1 mL/kg)，每日1次連續(xù)給藥7 d后進(jìn)行行為學(xué)評價。

1.3 大鼠MCAO模型制備

大鼠適應(yīng)環(huán)境7 d后，通過線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型，術(shù)前12 h禁食不禁水。參照Longa法[11]建立大鼠MCAO模型。大鼠深度麻醉后仰臥位固定于手術(shù)臺上。備皮，碘伏消毒。沿頸正中線切開皮膚，鈍性分離右側(cè)頸部肌肉，暴露右側(cè)頸總動脈、頸外動脈及頸內(nèi)動脈。結(jié)扎頸總動脈近心端及頸外動脈，在距分支5 mm處用動脈夾夾閉頸總動脈遠(yuǎn)心端。在頸總動脈遠(yuǎn)心端結(jié)扎處與動脈夾之間剪一小口，由此插入0.26 mm的圓頭硅化栓線[用0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚賴氨酸包被]至頸內(nèi)動脈，最終栓線頭部膨大端進(jìn)入大腦中動脈阻斷血流供應(yīng)。缺血2 h后小心抽出栓線，實現(xiàn)缺血再灌注。假手術(shù)組大鼠只進(jìn)行手術(shù)過程而不插栓線。

1.4 神經(jīng)功能缺損癥狀評分

各組動物分別在術(shù)后給藥7 d后進(jìn)行神經(jīng)功能缺損癥狀評分觀察，參照Chen等[12]采用的神經(jīng)功能缺損評分(Modified Neurological Severity Scores，mNSS)方法進(jìn)行評價，此評分系統(tǒng)由一系列行為學(xué)評價方法組成，包括運動、感覺、反射和平衡能力測試等，分?jǐn)?shù)越高表明神經(jīng)功能受損越嚴(yán)重，最高分為18分。

1.5 透射電鏡檢測

動物行為學(xué)檢測結(jié)束后，每組各3只大鼠深度麻醉后用4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛灌注取腦。后置于2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛-2.5%(體積分?jǐn)?shù))戊二醛中，4 ℃固定2 h；二甲砷酸鈉緩沖液洗標(biāo)本3次，PBS清洗后，加入1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))鋨酸4 ℃固定2 h；雙蒸水沖洗3次。乙醇梯度脫水：50%(體積分?jǐn)?shù))乙醇10 min，70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇(飽和鈾)過夜，90%(體積分?jǐn)?shù))乙醇10 min，100%(體積分?jǐn)?shù))乙醇2次，各15 min。用包埋劑(環(huán)氧丙烷、樹脂)滲入到組織內(nèi)部取代脫水劑。組織塊移入裝滿環(huán)氧樹脂Epon812的膠囊中，置烤箱加溫聚合。半薄切片，厚度1 μm，光學(xué)顯微鏡觀察定位。超薄切片機切片，厚度80 nm。醋酸雙氧鈾染色20 min，檸檬酸鉛染色5～10 min。切片干燥后，在透射電鏡下觀察線粒體的超微結(jié)構(gòu)，在20 000倍下拍照。

1.6 Western blotting法檢測

動物行為學(xué)檢測結(jié)束后，每組各3只大鼠斷頭處死后于冰浴下迅速分離各腦區(qū)，并分為左右半球，投入液氮中保存，用于Western blotting法檢測。取各組大鼠損傷側(cè)大腦皮質(zhì)組織用蛋白裂解液(RIPA∶蛋白磷酸酶抑制劑∶PMSF = 100∶2∶1)裂解，采用BCA法定量蛋白濃度。各組蛋白樣品變性后取相同蛋白量進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)分離，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉封閉后，加入適當(dāng)濃度的一抗，4 ℃過夜。TBST 洗膜3次，加入相應(yīng)的二抗室溫下孵育1 h；棄去二抗，TBST 洗膜3次。于化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀中滴加ECL化學(xué)發(fā)光試劑曝光得到適宜條帶，使用GelPro 3.1密度分析軟件對圖像中目的蛋白條帶進(jìn)行定量分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CIG對MCAO模型大鼠神經(jīng)功能評分的影響

5組大鼠間給藥治療7 d后，mNSS評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，假手術(shù)組大鼠無明顯的神經(jīng)功能損傷，得分為0，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠mNSS得分明顯增加，得分為(5.33±0.62)分，損傷較重，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；60 mg/kg和120 mg/kg 劑量的CIG及陽性藥銀杏葉片均可以改善這種損傷，mNSS分別降低至(2.71±0.42)分、(2.83±0.48)分和(2.28±0.36)分，給藥組大鼠mNSS得分與模型組大鼠比較顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 CIG對MCAO模型大鼠梗死側(cè)皮質(zhì)線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響

采用透射電鏡觀察各組大鼠損傷側(cè)皮質(zhì)組織神經(jīng)元內(nèi)的線粒體損傷情況。假手術(shù)組大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)均比較完整，線粒體嵴明顯，無空泡；而MCAO模型組大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中線粒體損傷較重，表現(xiàn)為線粒體腫脹，體積增大，嵴斷裂，外膜破裂，并有空泡樣變；60、120 mg/kg 劑量的CIG及陽性藥給藥線粒體結(jié)構(gòu)清晰，明顯改善線粒體結(jié)構(gòu)變化，減輕線粒體損傷(圖1)。

2.3 CIG對MCAO模型大鼠梗死側(cè)皮質(zhì)線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

采用Western blotting法檢測缺血再灌注損傷7 d后各組大鼠線粒體自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)變化情況。各組間大鼠損傷側(cè)皮質(zhì)中線粒體自噬蛋白NIX和Beclin1蛋白的表達(dá)水平，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較結(jié)果，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠損傷側(cè)皮質(zhì)中線粒體自噬蛋白NIX表達(dá)明顯降低(P<0.05)；Beclin1蛋白的表達(dá)也有明顯下降趨勢。經(jīng)過7 d的治療后，120 mg/kg劑量組CIG給藥能顯著上調(diào)NIX和Beclin1的表達(dá)(P<0.01)，詳見圖2。

圖1 CIG對MCAO大鼠損傷側(cè)皮質(zhì)神經(jīng)元中線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響

圖2 CIG對MCAO大鼠損傷側(cè)皮質(zhì)線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.4 CIG對MCAO模型大鼠梗死側(cè)皮質(zhì)線粒體分裂、融合、生成相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

采用Western blotting法檢測缺血再灌注損傷7 d后各組大鼠皮質(zhì)組織線粒體分裂、融合、生成相關(guān)蛋白的表達(dá)變化情況。各組間大鼠損傷側(cè)皮質(zhì)組織中線粒體分裂蛋白DRP1、線粒體融合蛋白OPA1、負(fù)責(zé)線粒體生成過程蛋白PGC-1α的表達(dá)水平，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠各蛋白的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，經(jīng)過7 d不同劑量的CIG給藥治療后，CIG給藥組中大鼠的DRP1、OPA1和PGC-1α的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，詳見圖3。

圖3 CIG對MCAO大鼠損傷側(cè)皮質(zhì)DRP1、OPA1和PGC-1α蛋白表達(dá)的影響

3 討論

腦缺血/再灌注損傷是缺血性腦血管病血管再通后，由于血液灌注而引起的加重缺血組織損傷的病理現(xiàn)象。本研究采用MCAO模型大鼠模擬腦缺血再灌注損傷，CIG給藥7 d后可顯著改善大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀，包括對于運動、感覺、反射和平衡能力等方面的改善，提示其對急性腦缺血再灌注模型大鼠具有良好的腦保護(hù)作用。

腦缺血再灌注是一個復(fù)雜的過程，包括能量代謝障礙、氧化應(yīng)激、鈣超載、炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、興奮性毒性等在內(nèi)均與腦缺血再灌注損傷病程及損傷程度密切相關(guān)，這些環(huán)節(jié)互為因果，彼此重疊。線粒體能量代謝障礙被認(rèn)為是腦缺血后系列損傷的源頭及始動環(huán)節(jié)[13-14]，而再灌注期間功能障礙的線粒體可繼續(xù)產(chǎn)生大量的活性氧，活性氧又以細(xì)胞內(nèi)線粒體為首要攻擊目標(biāo)，引起超氧化物自由基、羥基自由基、過氧化氫等增多，造成DNA損傷、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化，最終引起或加重神經(jīng)元損傷[15]。因此受損的線粒體會成為擴(kuò)大缺血再灌注損傷的繼發(fā)性關(guān)鍵因素，同時維持正常的線粒體結(jié)構(gòu)及功能也是決定神經(jīng)細(xì)胞能否存活的關(guān)鍵因素。本研究中MCAO大鼠梗死側(cè)皮質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)損傷明顯，發(fā)生線粒體腫脹及空泡樣變，而CIG給藥能夠有效減輕線粒體損傷，保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)完整。

線粒體內(nèi)存在多層次調(diào)控機制以維持線粒體網(wǎng)絡(luò)功能穩(wěn)態(tài)，包括清除、防御、修復(fù)與更新等。與之對應(yīng)的生物學(xué)過程則包括線粒體自噬、線粒體分裂、線粒體融合及線粒體生物合成等過程[16]。線粒體自噬是清除功能異?；蚶匣€粒體的選擇性自噬過程，通過將受損線粒體隔離成為自噬小體，隨后經(jīng)由溶酶體途徑將其降解。線粒體自噬作為一種早期防御保護(hù)機制有助于清除受損線粒體，阻斷由受損線粒體傳出的損傷信號，維持自身穩(wěn)態(tài)平衡及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，并通過降解成分再利用，實現(xiàn)線粒體更新，維持細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量與質(zhì)量相對平衡[17]。NIX作為線粒體自噬受體蛋白介導(dǎo)受損線粒體進(jìn)入自噬過程[18]。Beclin1是自噬的調(diào)節(jié)蛋白，主要調(diào)控自噬體的形成，其表達(dá)水平與自噬活性密切相關(guān)，并且也參與了線粒體自噬[19]。本研究結(jié)果顯示MCAO模型大鼠NIX及Beclin1的表達(dá)均明顯降低，說明缺血再灌損傷7 d后皮質(zhì)神經(jīng)元線粒體自噬水平較低，而CIG給藥可顯著增加NIX和Beclin1的表達(dá)，提示CIG可激活線粒體自噬水平，促進(jìn)受損線粒體的清除。

線粒體自噬同時協(xié)同線粒體分裂融合的循環(huán)，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，提高細(xì)胞生存率。線粒體分裂主要由DRP1介導(dǎo)，一旦啟動分裂過程，DRP1則轉(zhuǎn)位于線粒體外膜，與線粒體結(jié)合蛋白共同擠壓收縮使線粒體分裂，通過此過程將含有受損蛋白質(zhì)或突變mtDNA的功能異常線粒體部分分離。線粒體分裂可產(chǎn)生新的健康線粒體繼續(xù)供能，而受損的線粒體部分則由線粒體自噬清除，以此來避免線粒體破裂的發(fā)生。OPA1主要負(fù)責(zé)線粒體內(nèi)膜的融合，線粒體融合有利于線粒體網(wǎng)絡(luò)之間內(nèi)容物的相互交換，以此使得受損線粒體從健康線粒體處獲得必需物質(zhì)重新組裝成健康線粒體。研究[20]顯示在營養(yǎng)缺乏時，線粒體可通過延長自身來最大限度增加能量生成從而促使細(xì)胞存活。線粒體生成主要由PGC-1α介導(dǎo)，保證新生線粒體的不斷供應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，腦缺血再灌注損傷7 d后，與假手術(shù)組大鼠相比，MCAO模型大鼠損傷側(cè)皮質(zhì)神經(jīng)元中DPR1、OPA1和PGC-1α的表達(dá)均明顯降低，提示此時腦內(nèi)線粒體分裂融合和線粒體生物合成過程均被抑制，而CIG給藥可顯著改善這一變化，增加DPR1、OPA1和PGC-1α蛋白的表達(dá)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示CIG可顯著改善MCAO模型大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀，增加NIX、Beclin1、DRP1、OPA1和PGC-1α蛋白的表達(dá)，激活線粒體自噬，促進(jìn)線粒體分裂融合，增加線粒體生物合成，從而減輕線粒體損傷，對抗缺血再灌注，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。