吳西抗 王 躍 賀慧穎*

(1. 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理系 北京大學(xué)第三醫(yī)院病理科,北京 100191；2. 北京大學(xué)首鋼醫(yī)院病理科,北京 100144)

尿路上皮癌(urothelial carcinomas，UCs)是第四大常見的腫瘤[1-2]。UCs可以發(fā)生在下尿路(膀胱和尿道)或上尿路(腎盂和輸尿管)。其中膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma，BUC)占UCs的90%～95%，是最常見的尿路上皮惡性腫瘤[3]。上尿路尿路上皮癌(upper tract urothelial carcinoma, UTUC)在全球范圍內(nèi)是一種相對少見的、具有高復(fù)發(fā)率和進(jìn)展率的惡性侵襲性腫瘤，約60%的UTUC患者在診斷時腫瘤已發(fā)生浸潤[2]。在西方國家，UTUC占所有尿路上皮惡性腫瘤的5%～10%，其發(fā)病率約為2/100 000[2]。在中國，UTUC流行病學(xué)和臨床特點與西方國家有明顯的差異，表現(xiàn)為發(fā)病率較高，UTUC的發(fā)病率約為8/100 000，約占尿路上皮癌的20%～30%；且更好發(fā)于女性，男女比例為1∶1.3，而在歐洲國家男女比例約為3∶1；輸尿管UTUC的發(fā)病率為西方國家的2倍；相對于男性患者，女性患者具有分期高、體積大和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高的臨床特點；在中國，主要的危險因素為服用含有馬兜鈴酸的中藥，而在西方國家為煙草[2, 4-5]。鑒于UTUC在中國具有特殊的發(fā)病情況，因此尋找國人UTUC的預(yù)后因素具有重要的意義。以往的報道表明，Slit引導(dǎo)配體3(Slit guidance ligand 3，Slit3)在甲狀腺癌[6]、惡性黑色素瘤[7]及結(jié)直腸癌[8]等腫瘤中起抑癌作用。本研究通過檢測UTUC標(biāo)本中Slit3的表達(dá)情況，探究Slit3表達(dá)與UTUC患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2007年1月至2017年3月在北京大學(xué)首鋼醫(yī)院和北京大學(xué)第三醫(yī)院行腎輸尿管根治術(shù)的90例UTUC患者的常規(guī)石蠟標(biāo)本及臨床病理資料，患者術(shù)前或術(shù)后均未接受化學(xué)藥物治療(以下簡稱化療)，部分患者在復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移時接受了放射治療。所有病例的病理信息均經(jīng)兩位泌尿病理醫(yī)生獨立評價。根據(jù)第8版AJCC腎盂和輸尿管癌TNM分期[9]對病例進(jìn)行分期。按照2016年WHO泌尿系統(tǒng)腫瘤分類對病例進(jìn)行分級[10]。

1.2 組織微陣列(tissue microarrays，TMA) 的構(gòu)建

TMA由90例UTUC樣本和12例腫瘤周邊的正常尿路上皮樣本組成。基于先前的研究[11]，每個病例人工選擇3個直徑為2 mm的最佳腫瘤區(qū)域，通過手動式取樣槍將其精確地排列到預(yù)制的TMA石蠟塊中。

1.3 免疫組織化學(xué)方法

免疫組織化學(xué)染色采用EnVision兩步法，用PBS代替一抗作為陰性對照，以正常尿路上皮作為陽性對照，使用兔抗人Slit3多克隆抗體(上海BBI生命科學(xué)有限公司；1∶200，4 ℃濕孵過夜)及二抗(HRP-抗鼠抗兔IgG，丹麥DAKO公司)進(jìn)行染色。免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果由兩名病理醫(yī)師采用雙盲法閱片，由于腫瘤細(xì)胞染色表現(xiàn)為胞質(zhì)染色全或無，故僅根據(jù)細(xì)胞染色強度判定。按染色強度計分：無陽性著色計為0分，淺黃色計為1分，棕黃色計為2分，棕褐色計為3分。在后續(xù)的數(shù)據(jù)分析中，0分和1分歸為低表達(dá)組，2分和3分歸為高表達(dá)組。

1.4 隨訪

每六個月更新患者隨訪數(shù)據(jù)，直至2017年6月。其中10名患者在手術(shù)后失訪，最終有80例進(jìn)行生存分析，中位隨訪28個月(1～101個月)。定義術(shù)后膀胱復(fù)發(fā)為在膀胱鏡復(fù)查中發(fā)現(xiàn)膀胱腫物，并通過病理學(xué)確認(rèn)。無病生存期(disease free survival，DFS)定義為UTUC手術(shù)與死亡之間的間隔。因UTUC發(fā)生死亡為事件，因其他原因死亡或仍存活的患者在末次隨訪時為刪失。癌特異性生存期(cancer-specific survival，CSS)定義為從疾病診斷之日起到疾病出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的時間。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，分類變量組間比較采用卡方檢驗和Fisher確切概率法；兩個因素之間的相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析；Pearson相關(guān)分析用于檢驗Slit3表達(dá)和UTUC臨床病理特征的關(guān)系；生存分析單因素采用Kaplan-Meier法，多因素分析采用Cox回歸模型。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理特征

本研究共納入UTUC病例90例，患者發(fā)病年齡為41～88歲，平均年齡(68±9)歲，中位年齡為70歲。女性患者36例，男性患者54例。發(fā)生在左側(cè)上尿路43例，右側(cè)上尿路47例。其中發(fā)生在腎盂者38例，腎盂輸尿管連接處1例，輸尿管共6例，三處均有共6例。影像學(xué)等資料均未顯示伴有膀胱癌。腫瘤最大徑<3 cm者共51例，最大徑≥3 cm者共39例。13例為多灶分布。高級別UTUC 64例，低級別UTUC 26例。Ta～T1期患者共38例，T2～T4期患者共52例，其中伴有腎小球硬化的27例。腫瘤伴有大片壞死者10例。具有神經(jīng)侵犯者5例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者9例。發(fā)生膀胱復(fù)發(fā)的18例。

2.2 Slit3在UTUC中的表達(dá)

Slit3陽性定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色或褐色顆粒狀，在癌旁正常尿路上皮中均呈強陽性。在90例UTUC中，44例為高表達(dá)，46例為低表達(dá)。在Slit3高表達(dá)的病例中，26例為高級別UTUC，18例為低級別UTUC；在Slit3低表達(dá)的病例中，38例為高級別UTUC，8例為低級別UTUC(圖1)。

2.3 Slit3表達(dá)與UTUC臨床病理特征的關(guān)系

圖1 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

UTUC中Slit3表達(dá)與組織學(xué)分級(P=0.014)、腫瘤分期(P=0.006)相關(guān)，表明Slit3低表達(dá)的UTUC患者往往具有更高的組織學(xué)分級以及更晚的病理分期；同時Slit3低表達(dá)者具有更高的術(shù)后膀胱復(fù)發(fā)率。而Slit3表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤發(fā)生部位、脈管內(nèi)癌栓、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、壞死和多灶分布等無關(guān)(表1)。

2.4 Slit3與UTUC患者預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier單因素分析顯示Slit3低表達(dá)的UTUC患者其DFS為45.5個月；而高表達(dá)組其DFS為84.0個月，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.006)(圖2A)。此外Slit3低表達(dá)的UTUC患者其CSS為58.6個月，而高表達(dá)組其CSS為84.9個月，二者差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.015)(圖2B)。進(jìn)一步，分別以CSS、DFS為因變量，表1中的因素為自變量進(jìn)行多因素Cox回歸分析，結(jié)果Slit3的表達(dá)狀態(tài)對UTUC患者DFS和CSS的影響差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

3 討論

UTUC在歐美國家是一種相對少見的惡性腫瘤，然而在中國UTUC的發(fā)病率約為歐美國家的2～3倍，且預(yù)后相對較差，且具有較為特殊的臨床表現(xiàn)，如女性相對常見、與含有馬兜鈴酸的中藥等具有相關(guān)性[2]。臺灣學(xué)者Lee等[12]對2例高級別UTUC女性患者的腫瘤組織和正常組織進(jìn)行二代測序分析，首次發(fā)現(xiàn)在高級別UTUC中Slit3呈低表達(dá)，因此在90例國人UTUC患者中對Slit3的表達(dá)與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行探討。

Slit3最早發(fā)現(xiàn)于黑腹果蠅中[13]，隨后在果蠅的中樞神經(jīng)系統(tǒng)也發(fā)現(xiàn)了Slit3，并成功克隆[14]。在脊柱動物中Slit3具有3種同源亞型，分別為Slit1、Slit2和Slit3，其中Slit3由N末端信號肽、1個層黏連蛋白-G樣結(jié)構(gòu)域、4個富含亮氨酸的重復(fù)單位D1～D3、9個表皮生長因子重復(fù)序列和C末端半胱氨酸結(jié)構(gòu)域組成，具有高度保守性[15]。Robo是Slit3的單跨膜受體，又稱Robo受體。在哺乳類動物中，Robo受體具有4個亞型，分別為Robo1、Robo2、Robo3和Robo4。正常生理狀態(tài)下，Slit3廣泛表達(dá)于腦、心、肝、腎、骨骼肌等組織器官的線粒體中，通過和Robo4受體參與多種器官形成等生理功能。除此之外，Slit3還表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，具有較強的促血管生成的作用[16-17]。

表1 Slit3表達(dá)與UTUC臨床病理特征的關(guān)系

*n=80;Slit3： Slit guidance ligand 3;UTUC: upper tract urothelial carcinoma.

圖2 表達(dá)不同Slit3 UTUC患者Kaplan-Meier 生存曲線

病理狀態(tài)下，Slit3在多種實體瘤中均有表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞的運動、生長及侵襲等生物學(xué)行為[18-19]?？傮w上Slit3發(fā)揮抑癌的作用，如Yu等[8]研究顯示，在結(jié)直腸癌組織中，Slit3基因表達(dá)水平低于正常組織；在透明細(xì)胞性腎細(xì)胞癌和甲狀腺癌中Slit3均表現(xiàn)為基因表達(dá)水平下調(diào)[6,20]；此外也有研究[7]顯示Slit3參與組成的肽合物可以抑制惡性黑色素瘤細(xì)胞的侵襲能力。

基于以上的發(fā)現(xiàn)，筆者進(jìn)一步研究及驗證Slit3在UTUC中的表達(dá)及意義。結(jié)果顯示與Slit3高表達(dá)的UTUC患者相比，Slit3低表達(dá)者往往具有組織學(xué)分級高、腫瘤分期晚和膀胱復(fù)發(fā)率高的特點。同時Slit3低表達(dá)的患者往往具有較低的DFS和CSS。但多因素分析顯示Slit3并非UTUC的獨立預(yù)后因素。

表2 影響 UTUC患者CSS、DFS的多因素COX分析

有研究顯示Slit3作為miR-218-2的宿主基因，二者能夠發(fā)揮協(xié)同作用，抑制多種腫瘤，如甲狀腺癌[6]、結(jié)直腸癌[8]和胃癌[19]等腫瘤細(xì)胞的增生、遷移和轉(zhuǎn)移。但目前并未發(fā)現(xiàn)在UTUC中存在miR-218-2的表達(dá)異常[10]，提示有其他的miRNA 參與Slit3對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)的調(diào)控。有報道[21]顯示Slit3的表達(dá)與腫瘤的分子亞型有關(guān)，如在EB病毒陽性和微衛(wèi)星不穩(wěn)定亞型的胃癌中表達(dá)降低，而在基因組穩(wěn)定亞型的胃癌中表達(dá)升高。最近有研究[22]顯示UTUC可分為四種具有不同生物學(xué)行為的分子亞型，而Slit3是否與UTUC分子亞型相關(guān)，則需進(jìn)一步深入研究 。