郭晶晶 方 茜 劉亞楠 曲 沛 馬雪瀛 王 爽 方 偉 周 茹 張 響 湯云霞 楊思園 于鳳婷 王雅杰*
(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院檢驗(yàn)科,北京 100015;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院感染急診中心實(shí)驗(yàn)室,北京 100015)
2019年12月,新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)疫情發(fā)生以來,此疫情已成為全世界高度關(guān)注和共同面對的嚴(yán)峻問題[1-3]?;颊叩结t(yī)院就診所采集的標(biāo)本類型和質(zhì)量,關(guān)系到是否及時準(zhǔn)確的確診結(jié)果,為比較不同呼吸道標(biāo)本的病毒核酸檢測效果[4],本研究對31 例新型冠狀病毒確診病例的咽拭子與痰標(biāo)本進(jìn)行病毒核酸結(jié)果的比較。
收集自 2020 年2 月1 日至2月15日首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院檢測的918份樣本中31例確診為新型冠狀病毒陽性患者同一時間采集的咽拭子與痰標(biāo)本,對結(jié)果進(jìn)行觀察比較。31例確診患者中,男性11例(35.48%),女性20例(64.52%),年齡32~92歲。
RNA 提取:對臨床采集的標(biāo)本進(jìn)行水浴56 ℃,30 min滅活;咽拭子直接水浴56 ℃,30 min滅活;黏稠的痰,加入適量的痰消化液,10 min,待呈均質(zhì)后水浴56 ℃,30 min滅活。提取病毒的 RNA 采用 QIAamp viral RNA mini kit(Qiagen公司, 德國)試劑盒,從 140 μL 的標(biāo)本(咽拭子和痰標(biāo)本)中獲得 60 μL 的總RNA溶液,提取的RNA立即使用。
采用熒光PCR方法進(jìn)行檢測,儀器為ABI 7500,應(yīng)用2019株新型冠狀病毒(2019-novel coronavirus, 2019-nCoV)核酸檢測試劑盒(上海伯杰醫(yī)療科技有限公司)進(jìn)行人體上皮細(xì)胞基因RNP、病毒ORF1ab基因、N基因的檢測。按照試劑盒說明書配制體系,ABI 7500 熒光定量 PCR 儀不選 ROX 校正,淬滅基團(tuán)選 None, 反應(yīng)程序見表1。判定標(biāo)準(zhǔn):陽性(Ct值≤38,典型擴(kuò)增曲線),灰區(qū)(Ct值>38),陰性(Ct值>38 或無,無擴(kuò)增曲線)。
表1 反應(yīng)程序
2020年2月1日至2月15日首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院檢測新型冠狀病毒肺炎核酸標(biāo)本數(shù)量為918份,其中咽拭子標(biāo)本617份(67.21%),痰標(biāo)本230份(25.05%),鼻咽標(biāo)本38份(4.14%),血漿和尿的數(shù)量分別為17份(1.85%)、16份(1.74%)(表2)。
表2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院檢測新型冠狀病毒肺炎核酸標(biāo)本類型及數(shù)量
咽拭子標(biāo)本所占比例為67.21%,痰標(biāo)本所占比例為25.05%,鼻咽拭子所占比例為4.14%,其他標(biāo)本所占比例均小于2%。痰標(biāo)本的陽性率為36.52%,咽拭子陽性率為12.64%,鼻咽拭子陽性率為13.16%,血漿和尿的陽性率為0。31例患者在確診后,住院治療期間,同一時間留取咽拭子和痰標(biāo)本的核酸檢測對比結(jié)果見表3。
31例病例的咽拭子和痰標(biāo)本中,人體上皮細(xì)胞RNP基因均呈現(xiàn)明顯典型的擴(kuò)增信號曲線。31例患者的咽拭子核酸結(jié)果中,28例患者均顯示陰性,第9例和第16例患者的咽拭子為單基因陽性,第17例為雙基因陽性;同時采集的痰標(biāo)本結(jié)果顯示,18例患者均為單基因陽性,13例患者為雙基因陽性。痰標(biāo)本的病毒ORF1ab基因和N基因核酸檢測擴(kuò)增曲線的Ct值小于咽拭子標(biāo)本的Ct值。
從918份樣本數(shù)據(jù)的類型分布看,咽拭子標(biāo)本所占比例為67.21%,痰標(biāo)本所占比例為25.05%,鼻咽拭子所占比例為4.14%,其他標(biāo)本所占比例均小于2%。咽拭子標(biāo)本所占比例較高,這符合臨床標(biāo)本采集指南,而且對于臨床的實(shí)際操作較之其他標(biāo)本類型,更簡單易行。但是從各類標(biāo)本的陽性率看,痰標(biāo)本的陽性率為36.52%,咽拭子陽性率為12.64%,鼻咽拭子陽性率為13.16%,血漿和尿的陽性率為0。
表3 31例2019-nCoV確診病例咽拭子和痰標(biāo)本相關(guān)基因核酸檢測Ct值
RNP: ribonucleoprotein;Ct: cyde threshold.
31例新型冠狀病毒確診病例的咽拭子與痰標(biāo)本分別進(jìn)行人體上皮細(xì)胞RNP基因,病毒ORF1ab基因、N基因核酸檢測結(jié)果進(jìn)行比較(表2)。
通過檢測咽拭子和痰標(biāo)本的人體上皮細(xì)胞RNP基因來評估標(biāo)本的采集質(zhì)量及核酸提取質(zhì)量,人體上皮細(xì)胞RNP基因均呈現(xiàn)明顯典型的擴(kuò)增信號曲線,表明這31例新型冠狀病毒確診病例的咽拭子與痰標(biāo)本的標(biāo)本質(zhì)量及核酸提取效果均符合要求[5]。
對于新型冠狀病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測,本研究采用實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)指南[6]發(fā)布的 2019-nCoV熒光PCR檢測引物和探針,對31例 2019-nCoV 確診病例的咽拭子和痰標(biāo)本分別進(jìn)行病毒ORF1ab基因及N基因核酸檢測。痰標(biāo)本的病毒含量均高于咽拭子標(biāo)本,痰標(biāo)本的檢測效果優(yōu)于咽拭子。
病毒ORF1ab基因、N基因的檢測結(jié)果顯示,31例患者的咽拭子核酸結(jié)果中,28例患者均顯示陰性,第9例和第16例患者的咽拭子為單基因陽性,第17例為雙基因陽性;同時采集的痰標(biāo)本結(jié)果顯示,18例患者均為單基因陽性,13例患者為雙基因陽性。痰標(biāo)本的病毒ORF1ab基因和N基因核酸檢測擴(kuò)增曲線的Ct值小于咽拭子標(biāo)本的Ct值。這可能與痰標(biāo)本的病毒含量高于咽拭子標(biāo)本有關(guān),依據(jù)標(biāo)本采集指南[7]、臨床表現(xiàn)咳嗽、肺炎等,新型冠狀病毒主要侵襲感染下呼吸道細(xì)胞,所以采集下呼吸道標(biāo)本對病毒的檢出更加有優(yōu)勢,咽拭子檢出率低,有可能與護(hù)士采樣手法、采樣位置靠近咽部外側(cè)或患者病程所含病毒量不同有關(guān)。
本研究結(jié)果也提示,在新型冠狀病毒感染肺炎病例實(shí)驗(yàn)室確診及出院實(shí)驗(yàn)室診斷時,以咽拭子病毒核酸檢測陰性作為排除感染及治愈標(biāo)準(zhǔn)在實(shí)施過程中需謹(jǐn)慎,必要時應(yīng)當(dāng)采集痰等下呼吸道標(biāo)本進(jìn)行檢測。
患者到醫(yī)院就診所采集的標(biāo)本類型和質(zhì)量,關(guān)系到檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性[8-9],也關(guān)系到是否及時準(zhǔn)確的確診[10],早發(fā)現(xiàn)、早隔離、早治療,從而減少健康人群被感染的概率[11-13]。本研究結(jié)果為新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室檢測[14-15]中標(biāo)本的類型選擇及防控措施等提供了一些建議。由于標(biāo)本數(shù)量較少,在此后工作中,將進(jìn)一步收集更多的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析,為患者的早日康復(fù),提供更有利的科學(xué)證據(jù)。