賀文芳，周 柯，周 磊，劉家云，馬越云，閆 沛，徐修禮，郝曉柯

(空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院 1. 檢驗(yàn)科 全軍臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所； 2. 護(hù)理部；陜西 西安 710032)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)屬于人體正常菌群，也是條件致病菌，其引起的社區(qū)獲得性和醫(yī)院獲得性感染逐年增加，特別是高毒力肺炎克雷伯菌和多重耐藥肺炎克雷伯菌的傳播，給臨床治療帶來(lái)極大的困難[1]。臨床重癥感染患者的不斷增加，碳青霉烯類(lèi)抗生素的廣泛使用，使得耐碳青霉烯類(lèi)肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP)菌株檢出呈逐年增多的趨勢(shì)。CRKP具有在醫(yī)院廣泛傳播的潛在風(fēng)險(xiǎn)，其引發(fā)的臨床感染病死率較高，治療藥物有限，給患者、醫(yī)院和社會(huì)帶來(lái)極大的影響和危害[2]。多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing，MLST)和脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)是兩種最常用于細(xì)菌分型的分子生物學(xué)方法，可用于分析醫(yī)院分離CRKP的基因型和同源性，從切斷感染途徑方面入手指導(dǎo)、控制多重耐藥菌的傳播。本研究收集某醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)4個(gè)月內(nèi)連續(xù)檢出的10株CRKP，進(jìn)行抗菌藥物敏感性試驗(yàn)和碳青霉烯酶基因檢測(cè)，并應(yīng)用MLST和PFGE方法進(jìn)行菌株同源性分析，發(fā)現(xiàn)其傳播規(guī)律和流行特點(diǎn)，為醫(yī)院感染暴發(fā)的有效預(yù)防提供防控依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 菌株來(lái)源 收集2017年9—12月某三甲醫(yī)院ICU連續(xù)檢出的CRKP。

1.2 主要儀器試劑 VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)、GN革蘭陰性菌鑒定卡片、AST-GN13革蘭陰性菌藥敏卡片(法國(guó)Biomerieux)，GeneXpert分子診斷系統(tǒng)、XpertCarba-R碳青霉烯酶基因檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Cepheid)，抗菌藥物藥敏紙片(英國(guó)Oxoid)，血瓊脂培養(yǎng)基、M-H培養(yǎng)基(鄭州安圖生物)，質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC 25922，肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705和ATCC BAA1706(國(guó)家微生物菌種保藏中心)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增儀、凝膠電泳成像系統(tǒng)、CHEF MapperXa脈沖場(chǎng)凝膠電泳系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad)，限制性?xún)?nèi)切酶XbaI(中國(guó)TaKaRa)，Gel Red核酸染料(美國(guó)Biotium)。

1.3 抗菌藥物敏感性試驗(yàn) 采用VITEK 2 Compact系統(tǒng)和配套的細(xì)菌鑒定卡片、藥敏卡片進(jìn)行鑒定以及相應(yīng)的藥敏試驗(yàn)，檢測(cè)抗菌藥物的最低抑菌濃度(MIC)，采用K-B法補(bǔ)充檢測(cè)部分藥物敏感試驗(yàn)。藥敏結(jié)果依據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)藥敏試驗(yàn)2019年 M100-29th標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果。

1.4 碳青霉烯酶檢測(cè) 根據(jù)CLSI M100-29th腸桿菌科細(xì)菌碳青霉烯酶檢測(cè)方法進(jìn)行mCIM試驗(yàn)和eCIM試驗(yàn)，采用賽沛XpertCarba-R試劑盒檢測(cè)blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaOXA-48和blaIMP 5個(gè)碳青霉烯酶基因。

1.5 多位點(diǎn)序列分型(MLST) 采用煮沸法提取細(xì)菌DNA，PCR擴(kuò)增rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB和tonB 7個(gè)管家基因，引物參考Pasteur數(shù)據(jù)庫(kù)。PCR條件：94℃ 2 min，94℃ 30 s、50℃ 1 min、72℃ 30 s共35個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定為單一條帶后，送上海生工生物公司測(cè)序。將管家基因的序列在Pasteur數(shù)據(jù)庫(kù)(https://bigsdb.pasteur.fr/cgi-bin/bigsdb/bigsdb. pl?db =pubmlst_klebsiella_seqdef_public&page =sequenceQuery)進(jìn)行比對(duì)，獲得管家基因型別，將7個(gè)管家基因型別組合獲得菌株ST型別。

1.6 脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)分析 參考美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心(CDC)PulseNet提供的PFGE相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序，調(diào)整相關(guān)電泳條件，試驗(yàn)方法如下：用比濁儀調(diào)整細(xì)菌懸液濃度，達(dá)4.2～4.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝唬患尤?% Seakem Gold：1% SDS膠，混勻制備膠塊；用含蛋白酶K的細(xì)胞裂解液CLB在54℃水浴搖床中強(qiáng)力震蕩(170～180 r/min)消化2 h；用無(wú)菌純水洗滌膠塊2次，TE緩沖液洗滌膠塊3次；加入20U XbaⅠ限制性?xún)?nèi)切酶按比例配制酶切反應(yīng)體系，37℃水浴孵育6～8 h后，電泳儀中進(jìn)行脈沖場(chǎng)電泳；電泳參數(shù)為電場(chǎng)強(qiáng)度6 V/cm，夾角120度，初始脈沖為6 s，最終脈沖為36 s，電泳時(shí)間19 h；電泳結(jié)束后，使用Gel Red核酸染料染色，在美國(guó)Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)中成像保存圖片。

1.7 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用BioNumerics軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，選擇Diec相關(guān)系數(shù)和UPGMA方法。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共收集ICU CRKP菌株10株，分別標(biāo)為1、2、3…10號(hào)菌株，其中1～8、10號(hào)菌株分離自5例(分別標(biāo)為A、B、C、D、E)患者的臨床感染標(biāo)本，9號(hào)菌株分離自病房氣壓治療儀面板。5例患者均為男性，年齡28～55歲，平均(46.2±11.3)歲；患者A、C、D痰標(biāo)本，患者B血、引流液標(biāo)本，以及患者E血、分泌物標(biāo)本中各分離1株CRKP菌株，患者E痰標(biāo)本中先后分離2株CRKP。同期ICU醫(yī)生、護(hù)士的手，治療車(chē)、監(jiān)護(hù)儀、微量泵、血?dú)夥治鰞x、床欄、床頭柜、門(mén)把手，以及護(hù)士長(zhǎng)使用的電腦鍵盤(pán)等32個(gè)部位環(huán)境監(jiān)測(cè)標(biāo)本中均未分離出CRKP菌株。

2.2 藥敏結(jié)果 10株CRKP菌株對(duì)青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)和碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物均呈高水平耐藥；6～8號(hào)及10號(hào)CRKP菌株對(duì)四環(huán)素類(lèi)抗生素敏感，其余1～5號(hào)及9號(hào)CRKP菌株對(duì)包括替加環(huán)素在內(nèi)的四環(huán)素類(lèi)呈高水平耐藥。1～5號(hào)及9號(hào)CRKP菌株具有相同的耐藥表型，而6～8號(hào)及10號(hào)CRKP菌株具有相同的耐藥表型。見(jiàn)表1。

表1 10株CRKP菌株對(duì)抗菌藥物的敏感結(jié)果

注：R為耐藥；S為敏感。

2.3 碳青霉烯酶檢測(cè)結(jié)果 10株CRKP菌株mCIM試驗(yàn)均陽(yáng)性，eCIM試驗(yàn)均陰性。經(jīng)賽沛XpertCarba-R試劑盒檢測(cè)，均檢出blaKPC碳青霉烯酶基因。

2.4 MLST結(jié)果 CRKP 7個(gè)管家基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證結(jié)果如圖1所示。PCR測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAMAN比對(duì)、拼接，得到的序列上傳到Pasteur中KPNMLST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，10株CRKP均為ST 11型。

2.5 PFGE分型結(jié)果 10株CRKP菌株經(jīng)XbaI酶剪切， PFGE后得到5種帶型。其中2～5號(hào)及9號(hào)CRKP菌株電泳帶型完全一致，結(jié)合MLST均為ST 11型，考慮為同一來(lái)源，為流行菌株。1號(hào)CRKP菌株與流行菌株僅有1條條帶的差異，兩者親緣關(guān)系接近?；颊逧標(biāo)本中分離的6～8號(hào)和10號(hào)CRKP菌株有三種帶型，與流行菌株條帶相差3條以上，來(lái)自痰的6號(hào)和與來(lái)自血的10號(hào)菌株帶型相同，但與同來(lái)自于痰的7號(hào)菌株帶型不同。見(jiàn)圖2。

M：分子量標(biāo)準(zhǔn)；條帶1～7：依次為rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB、tonB基因。

圖1 CRKP管家基因PCR擴(kuò)增結(jié)果驗(yàn)證

Figure 1 PCR amplification results of CRKP house-keeping genes

圖2 10株CRKP PFGE及聚類(lèi)圖

3 討論

2018年CHINET細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)報(bào)道，在呼吸道分離的病原菌中，肺炎克雷伯菌已經(jīng)超過(guò)鮑曼不動(dòng)桿菌，躍居第一位，其在血等無(wú)菌體液的分離率也逐漸升高，僅次于大腸埃希菌，位于第二[3]。CRKP的分離率也居高不下，一項(xiàng)來(lái)自中國(guó)的多中心研究報(bào)道，在所有耐碳青霉烯類(lèi)腸桿菌科細(xì)菌(CRE)分離株中，CRKP占73.9%，耐碳青霉烯類(lèi)大腸埃希菌(16.6%)和陰溝腸桿菌(7.1%)次之；在所有住院患者中，CRE感染導(dǎo)致的病死率高達(dá)33.5%，而CRKP在血流感染和下呼吸道感染致死率則更高[4-5]。CRKP感染主要與肺炎克雷伯菌定植或感染病史、腸外營(yíng)養(yǎng)，使用第三代頭孢菌素或碳青霉烯類(lèi)抗生素有關(guān)[6]。

CRKP致死率高的原因之一是對(duì)抗菌藥物廣泛耐藥，文獻(xiàn)[4, 7]報(bào)道CRKP對(duì)頭孢菌素類(lèi)、喹諾酮類(lèi)耐藥率高達(dá)85%以上，對(duì)氨基糖苷類(lèi)的耐藥率較低，但也高達(dá)50%以上，而對(duì)革蘭陰性菌感染治療最后防線(xiàn)替加環(huán)素的敏感率僅有40.2%。本研究10株CRKP菌株中，6株對(duì)測(cè)試的所有抗菌藥物均耐藥。替加環(huán)素K-B紙片擴(kuò)散法的抑菌圈僅有7 mm，表現(xiàn)為高水平耐藥。CRKP對(duì)碳青霉烯類(lèi)耐藥的重要機(jī)制為產(chǎn)KPC酶，與國(guó)內(nèi)研究[8]一致，其對(duì)替加環(huán)素耐藥機(jī)制可能與外排泵表達(dá)上調(diào)等有關(guān)[9-10]。

國(guó)內(nèi)流行的CRKP主要為產(chǎn)KPC酶的ST 11型[11-12]，與本研究結(jié)果一致。但是不同醫(yī)院CRKP的流行基因型不盡相同[13-14]，研究CRKP的基因型別及同源性有助于監(jiān)測(cè)醫(yī)院感染及其發(fā)生路徑，能為切斷感染路徑，控制醫(yī)院感染提供依據(jù)。MLST和PFGE均可以用作細(xì)菌分型，且各有優(yōu)劣。前者分辨率高，重復(fù)性好，數(shù)據(jù)可共享，可進(jìn)行不同實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)，但是測(cè)序成本高，分析缺少基因組詳細(xì)信息或含有大量基因組島插入序列，不能單獨(dú)作為暴發(fā)溯源的工具；后者結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，可發(fā)現(xiàn)大片段的插入、缺失、重組等，酶切位點(diǎn)的點(diǎn)突變以及質(zhì)粒的獲得、丟失，但操作時(shí)間長(zhǎng)，受人為影響因素大，分析的是條帶而不是序列[15]，通常推薦將二者結(jié)合起來(lái)進(jìn)行同源性分析。

本研究中分離10株CRKP菌株的MLST均為ST 11型，未表現(xiàn)出菌株間差異；而通過(guò)PFGE分型得到5種帶型，其中11月22—28日分離的4株(2～5號(hào))菌株帶型與12月6日于氣壓治療儀面板分離的CRKP(9號(hào))完全一致。經(jīng)調(diào)查該儀器為科室共用設(shè)備，考慮本事件為氣壓治療儀為媒介的接觸傳播導(dǎo)致的醫(yī)院感染，該結(jié)論也表明在研究醫(yī)院感染闡明菌株同源性時(shí)PFGE是MLST的有力補(bǔ)充。2號(hào)和3號(hào)CRKP菌株分別分離自同一重癥胰腺炎患者的腹腔引流液和血標(biāo)本，其PFGE帶型完全一致，推測(cè)CRKP可能通過(guò)腹腔感染入血；6～8號(hào)和10號(hào)CRKP菌株分別分離自另一患者的痰、痰、引流液和血標(biāo)本，只有6號(hào)與10號(hào)菌株帶型完全相同，推測(cè)CRKP是通過(guò)呼吸道感染入血，同樣分離自痰的6號(hào)菌株與7號(hào)菌株同源性在85%以上，可能為變異株，而分離自分泌物的8號(hào)菌株帶型差異大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。以上兩組數(shù)據(jù)均表明 PFGE在明確細(xì)菌感染路徑方面的優(yōu)勢(shì)。值得注意的是分離自9月16日的1號(hào)菌株與本次醫(yī)院感染流行株的克隆僅差異一條條帶，Tenove等[16]認(rèn)為由于細(xì)菌具有變異性，在PFGE圖譜分析中，相似值在0.85以上的菌株可以判定為流行病學(xué)相關(guān)，由此可見(jiàn)本次流行菌株可能為1號(hào)菌株變異而來(lái)。

綜上所述，PFGE在明確醫(yī)院感染細(xì)菌傳播路徑，個(gè)體細(xì)菌感染路徑以及遺傳變異方面具有重要應(yīng)用價(jià)值。杜小莉等[17]也認(rèn)為PFGE在甄別暴發(fā)菌株、高度相關(guān)菌株和不相關(guān)菌株時(shí)有很好的甄別能力，并且分型結(jié)果與菌株分離病區(qū)、分離時(shí)間具有一致性。針對(duì)暴發(fā)流行菌株，PFGE能夠?qū)⑾嗤琈LST型別的菌株聚成一簇。此外，本研究也從科室環(huán)境、患者自身等多個(gè)角度發(fā)現(xiàn)，采取有效消毒隔離措施的重要性，尤其是患者共用設(shè)備，更需嚴(yán)格消毒管理，通過(guò)切斷感染路徑即可有效控制醫(yī)院感染的發(fā)生。