劉冰霜，王 臣, ，楊 沖, ，劉慶華，譚周亮

（1.中國科學(xué)院成都生物研究所/中國科學(xué)院環(huán)境與應(yīng)用微生物重點實驗室，四川 成都 610041；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

【研究意義】苯胺（aniline）作為芳香族化合物的一種，是300多種化學(xué)物質(zhì)的重要中間產(chǎn)物，廣泛應(yīng)用于染料、農(nóng)藥、塑料、橡膠添加劑、炸藥等行業(yè)［1］。苯胺自身穩(wěn)定性高、生物毒性大、難降解并具有“三致”作用，其在環(huán)境中的殘留將會對動、植物造成嚴(yán)重危害，被列入我國“十四類環(huán)境優(yōu)先污染物黑名單”及美國EPA“環(huán)境優(yōu)先控制污染物黑名單”（EPA; www.epa.gov）。因此，針對環(huán)境中苯胺的有效處理、減少其對環(huán)境的污染是污染防治領(lǐng)域中面臨的重要課題。由微生物介導(dǎo)的生物修復(fù)在此過程中展現(xiàn)出有效修復(fù)污染環(huán)境的巨大潛力，但因缺乏有關(guān)污染環(huán)境對微生物生長和代謝影響的信息，從而限制了微生物在環(huán)境修復(fù)中的應(yīng)用［35］。而通過對苯胺脅迫下苯胺降解微生物響應(yīng)機(jī)制的研究，將會豐富這一信息，并為進(jìn)一步調(diào)控提高微生物降解苯胺能力提供良好的靶點、為其生物修復(fù)研究奠定基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前苯胺的處理方法很多，因生物法處理苯胺具有成本低、經(jīng)濟(jì)效益高、環(huán)境友好性等優(yōu)點，近年來越來越多的苯胺降解菌被分離出來，如Klebsiellasp.ZL-1［2］、Pseudomonassp.Z1［3］、Rhodococcussp.Strain ATCC 49988［4］等，同時苯胺生物降解機(jī)理也得到了詳細(xì)綜述［5-6］。有研究指出，通過微生物脅迫響應(yīng)機(jī)制對環(huán)境微生物準(zhǔn)確調(diào)控將是一個強(qiáng)化微生物降解能力、提高修復(fù)效率的有效和通用解決途徑［7］。如 Wang等［8］研究了Rhodococcusruber TH3在熱激條件下的適應(yīng)機(jī)制，并通過過表達(dá)顯著響應(yīng)蛋白Hsp16成功提高了菌株在熱激、50%丙烯酰胺脅迫下的存活率。但在環(huán)境微生物苯胺脅迫響應(yīng)機(jī)制方面僅在RubrivivaxbenzoatilyticusJA2［9］菌株中被闡述，而作為生物修復(fù)最佳菌株之一的Rhodococcussp.苯胺響應(yīng)機(jī)制還不清楚。【本研究切入點】JA2菌株雖然對苯胺具有一定的耐受性，但其本身不具有苯胺的降解功能，也就是說目前對苯胺降解菌在適應(yīng)苯胺脅迫方面的研究還未見有報道。Rhodococcussp.AN-P1作為一株苯胺高效降解菌，可以降解和耐受30 ～ 40 mmol/L的苯胺，在2 000 mg/L苯胺條件下，可在32 h內(nèi)就能使出水達(dá)到《污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)》一級標(biāo)準(zhǔn)［10］，且基于AN-P1的生物強(qiáng)化序批式反應(yīng)器系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行后對苯胺及化學(xué)需氧量的去除率可分別超過96.3%和81.3%［11］。研究其在苯胺脅迫下的響應(yīng)機(jī)制，不僅可以解釋菌株AN-P1優(yōu)良的苯胺降解和耐受能力的原因，還可以豐富微生物對環(huán)境污染物響應(yīng)機(jī)制?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究采用雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)，分析AN-P1在苯胺脅迫下的蛋白質(zhì)表達(dá)響應(yīng)情況，揭示AN-P1苯胺降解途徑，闡述苯胺降解菌在苯胺脅迫下的適應(yīng)、降解機(jī)制，彌補(bǔ)苯胺降解菌對耐受、降解苯胺這一機(jī)制的空缺，并為提高環(huán)境微生物處理苯胺的能力奠定理論研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株及菌株培養(yǎng)

菌株AN-P1為實驗室保藏菌株，根據(jù)16S rDNA基因序列分析顯示該菌株屬于Rhodococcussp.（GenBank 登錄號：FJ827255）［10］。將 AN-P1菌株活化后，分別接種于以1 500 mg/L苯胺和10 g/L檸檬酸鈉為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在30℃、200 r/min的恒溫振蕩器中培養(yǎng)。無機(jī)鹽培養(yǎng)基組分：Na2HPO42 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.3 g/L、微量元素溶液5 mL/L，pH7.0，121℃滅菌 20 min。

1.2 蛋白質(zhì)樣品的制備

按上述培養(yǎng)方法將菌懸液培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.8～1.0之間。10 000 g，4 ℃條件下離心15 min棄上清液，用pH 7.2的磷酸鹽緩沖液洗滌菌體3次，再用雙蒸水洗滌菌體2次后，收集菌體。收集的菌體采用超聲破碎法提取蛋白質(zhì)：取一定量菌體，用1 mL裂解液（8 mol/L尿素，4% CHAPS，2 % IPG緩沖液，40 mmol/L DTT，1 mmol/L PMSF，1 μL（500 U）核酸酶充分懸浮菌體；再用杯式超生細(xì)胞粉碎機(jī)（Scientz08-I，寧波新芝）進(jìn)行超聲處理直至菌懸液清澈，最后20 000 r/min、4 ℃離心20 min，取上清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 雙向電泳及圖譜分析

用Bradford比色法［12］測定蛋白濃度，取2 mg蛋白質(zhì)樣品并將其固定在pH 4～7 IPG非線性梯度條（Bio-Rad, USA）上。第一維等電點聚焦（30 V，6 h；500 V，2 h；10 000 V，3 h；110 000 Vh）、膠平衡、第二維SDS-PAGE垂直電泳程序以及凝膠染色等步驟參照劉冰霜等實驗過程［13］。顯色后的凝膠用ImageScanner Ⅲ多功能激光掃描成像儀掃描獲取圖譜，再用凝膠分析軟件ImageMaster 2D Platinum 6.0 進(jìn)行雙向電泳的圖像分析。

1.4 蛋白質(zhì)表達(dá)差異點鑒定

在圖譜上標(biāo)記差異的蛋白質(zhì)點，并從膠上切取下來裝入EP管中，加雙蒸水保存。切取蛋白質(zhì)點委托北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解析電離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS，UltrafleXtrem，Bruke）鑒定，并根據(jù)各肽段M/Z數(shù)據(jù)，利用Mascot（http://www.matrixscience.com）軟件，在NCBInr蛋白數(shù)據(jù)庫中搜索理論上能與酶解肽段相匹配的蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙向電泳圖譜檢測

蛋白質(zhì)組學(xué)是分析細(xì)胞內(nèi)所有蛋白質(zhì)的高通量方法。而蛋白質(zhì)又是細(xì)胞生命活動中的重要功能生物分子，因此通過分析生物體內(nèi)蛋白質(zhì)水平變化對于檢測微生物在生物降解過程中的生理狀態(tài)非常重要［14］。本研究以檸檬酸鈉為唯一碳源培養(yǎng)的AN-P1蛋白組電泳圖中共檢測到579個蛋白質(zhì)點（圖1A）；而以苯胺唯一碳源培養(yǎng)的AN-P1蛋白組電泳圖中共檢測到681個蛋白質(zhì)點（圖1B）。對這些蛋白質(zhì)點進(jìn)一步分析和鑒定將有助于闡述苯胺降解菌對苯胺脅迫的適應(yīng)機(jī)制。

圖1 Rhodococcus sp.AN-P1在不同條件下蛋白質(zhì)組雙向電泳圖Fig.1 Two-dimensional electrophoresis diagram of the proteome of Rhodococcus sp.AN-P1 under different conditions

2.2 差異表達(dá)蛋白的鑒定

如圖1B中黑色方框所示，從以苯胺為唯一碳源的電泳圖譜中選取21個與檸檬酸鈉為唯一碳源電泳圖譜顯著差異的蛋白質(zhì)點，利用質(zhì)譜進(jìn)行分析，獲得這些蛋白質(zhì)點的肽質(zhì)譜指紋圖譜。根據(jù)得到的肽質(zhì)譜指紋圖譜及其分子量范圍等數(shù)據(jù)，通過Mateix science網(wǎng)站提供的MASCOT軟件查詢與之相匹配的蛋白，如果蛋白質(zhì)點的Mascot得分大于82（P＜0.05）則認(rèn)為該蛋白點被成功鑒定，并從給出的候選蛋白中選擇與AN-P1最接近物種的蛋白質(zhì)作為鑒定結(jié)果，否則視為未得到鑒定。如表1所示，蛋白質(zhì)點Mascot得分大于82的共有17個，即成功鑒定17個蛋白質(zhì)點，有4個蛋白質(zhì)點未鑒定成功（未展示）。其中，成功鑒定的蛋白質(zhì)點按功能可分為信號傳導(dǎo)系統(tǒng)蛋白、氨基酸及能量代謝系統(tǒng)蛋白、細(xì)胞防御系統(tǒng)蛋白、苯胺降解酶等。另外，從蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量、等電點來看，大部分成功鑒定的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量在31 000 ～ 58 000之間，等電點位于4～7之間，證明本研究中選擇的IPG非線性梯度條非常適合該條件下物種蛋白質(zhì)的二維電泳分離。從蛋白質(zhì)匹配上的物種來看，17個蛋白質(zhì)點均來自于非Rhodococcussp.物種，這可能是由于AN-P1菌株屬于Rhodococcussp.新種或者是Rhodococcussp.蛋白組信息不全面所導(dǎo)致。

表1 苯胺誘導(dǎo)條件下的AN-P1蛋白斑點的鑒定Table 1 Identification of protein spots of AN-P1 induced under aniline conditions

3 討論

3.1 信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)系統(tǒng)

雖然苯胺可以作為碳源、氮源及能源被微生物所利用，但同時作為有機(jī)溶劑也會對AN-P1產(chǎn)生毒害影響。當(dāng)AN-P1暴露在苯胺環(huán)境中時，首先會通過信號傳導(dǎo)系統(tǒng)感知外界環(huán)境的變化，如組氨酸激酶（#3418）。組氨酸激酶是一個雙組分信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，其在感知脅迫存在及調(diào)節(jié)菌株適應(yīng)環(huán)境方面發(fā)揮重要作用［15］。如Erythrobacter litoralisDSM8509在響應(yīng)光照脅迫時可通過組氨酸激酶感知光照的改變進(jìn)而調(diào)控其他基因表達(dá)［16］。而為了適應(yīng)新環(huán)境，新蛋白質(zhì)的合成又是必不可少的，這一點也從檢測到與基因轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)蛋白的表達(dá)得到了驗證，如Fis族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子（#3095）、延伸因子Ts（#3584）的表達(dá)。

3.2 氨基酸及能量代謝

除上述參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)蛋白外，參與氨基酸合成的酶類在細(xì)胞適應(yīng)苯胺脅迫環(huán)境中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。如吲哚-3-磷酸甘油合成酶（#3559），一種色氨酸生物合成酶，其參與合成的色氨酸在多種脅迫條件下發(fā)揮作用［17-18］，可協(xié)助參與細(xì)胞壁的合成及脂質(zhì)代謝［19］。同時其他氨基酸代謝相關(guān)的蛋白也被檢測到，包括3-羥基異丁酸脫氫酶（#3496）（參與纈氨酸代謝）羥甲基戊二酰COA裂解酶（#3526）（參與亮氨酸代謝）、氨基轉(zhuǎn)移蛋白（#3422）等。這些變化可維持胞內(nèi)氨基酸平衡，滿足脅迫條件下蛋白質(zhì)合成增加的需求。另外，微生物在脅迫條件下為了抵抗脅迫環(huán)境往往對能量的需求也會增加［20］，研究表明AN-P1在苯胺脅迫條件下ATP合酶F1（#3398）上調(diào)表達(dá)，有助于生產(chǎn)更多的能量用于抵抗苯胺脅迫環(huán)境。

3.3 細(xì)胞防御系統(tǒng)

通過進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，AN-P1還可以調(diào)節(jié)GroEL（#3827）、DnaK（#3899）、UspA域蛋白（#3068）等細(xì)胞防御相關(guān)蛋白的表達(dá)，以適應(yīng)苯胺脅迫。研究表明，熱激蛋白（Heat shock protein，Hsp）GroEL和DnaK可在多種脅迫條件下響應(yīng)表達(dá)，如有機(jī)溶劑/有毒化學(xué)物質(zhì)脅迫［21］、高溫脅迫［22］以及其他氧化應(yīng)激脅迫［23］。熱激蛋白除了在防止蛋白質(zhì)變性、降解和聚集等方面發(fā)揮重要作用外，還可以提高細(xì)胞對脅迫的耐受力、維持細(xì)胞正常的代謝功能、提高細(xì)胞活力、減少環(huán)境脅迫造成的傷害［24］。通用應(yīng)激蛋白（Universal stress protein, Usp）則可以提高長期暴露于脅迫條件下細(xì)胞的存活率，保護(hù)細(xì)胞免受有毒化學(xué)物質(zhì)、滲透脅迫以及紫外線脅迫等的傷害［25］。因此，這些蛋白在AN-P1中的表達(dá)可能有助于提高細(xì)胞對苯胺脅迫的抵抗能力，從而達(dá)到適應(yīng)苯胺環(huán)境的需求。

3.4 苯胺降解酶系統(tǒng)

在不同底物條件下，微生物有著不同的代謝途徑，如Rhodococcus jostiiRHA1是利用β-酮己二酸代謝途徑代謝原兒茶酸、利用羥基喹啉代謝途徑代謝4-羥基水楊酸等［26］。在本研究中也檢測到一些與苯胺代謝相關(guān)的酶類，如環(huán)羥基化雙加氧酶α亞基（#3598）、末端雙加氧酶大亞基（#3593）以及鄰苯二酚2,3-雙加氧酶（#3544）。環(huán)羥基化是最常見的初始降解步驟之一，因此是環(huán)羥基化雙加氧酶也是芳香環(huán)起始降解的重要催化酶之一［27-28］。典型的環(huán)羥基化雙加氧酶由末端雙加氧酶和電子轉(zhuǎn)移酶組成，而末端加氧酶作為催化中心可以接收來自電子轉(zhuǎn)移組分的電子［29］。苯胺降解途徑表明，苯胺可在有氧條件下經(jīng)過苯胺環(huán)羥基化雙加氧酶被轉(zhuǎn)化為鄰苯二酚，然后鄰苯二酚再在鄰苯二酚1,2-雙加氧酶的作用下降解為cis,cis-粘康酸（鄰位代謝途徑）或在鄰苯二酚2,3-雙加氧酶作用下降解為2-羥基粘康半醛（間位降解途徑）［30］。由于本研究中檢測到鄰苯二酚2,3-雙加氧酶的表達(dá)，證明了AN-P1是以間位降解途徑來代謝苯胺的。AN-P1的這一苯胺代謝方式與Rhodococcus rhodochusstrain CTM［31］、Rhodococcussp.strain DK17［32］相同，但與Rhodococcus erythropolisAN-13［33］、Rhodococcussp.22［34］不同。

4 結(jié)論

苯胺作為重要的化工中間體，其在環(huán)境中的廣泛分布及對水生態(tài)的影響引起眾多學(xué)者的關(guān)注。就其生物降解途徑至今已得到詳細(xì)研究，但環(huán)境微生物對含苯胺環(huán)境的響應(yīng)機(jī)制還鮮有研究。本文通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，分析了苯胺降解菌Rhodococcussp.AN-P1在苯胺脅迫下的蛋白質(zhì)表達(dá)情況。研究結(jié)果表明，苯胺降解菌AN-P1在苯胺脅迫環(huán)境中會通過響應(yīng)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)感知外界脅迫、調(diào)節(jié)氨基酸及能量代謝系統(tǒng)抵抗苯胺的毒害影響、利用細(xì)胞防御系統(tǒng)進(jìn)一步提高其存活能力、表達(dá)苯胺降解酶系統(tǒng)降解苯胺獲得碳源、氮源及能量來源，從而形成AN-P1菌株在苯胺脅迫條件下的適應(yīng)及生存機(jī)制。另外，通過對AN-P1苯胺脅迫下蛋白組學(xué)的分析也揭示了AN-P1菌株是通過間位降解途徑來降解苯胺的。本研究不僅補(bǔ)充了苯胺降解菌在苯胺脅迫條件適應(yīng)機(jī)制的空白，本所鑒定的蛋白質(zhì)點可為將來進(jìn)一步調(diào)控提高微生物苯胺降解能力提供良好的靶點，為其生物修復(fù)研究奠定基礎(chǔ)。