楊麗萍　馬榮雪　周永?！〕痰腔ⅰ∥捍喝A　張顯　張勇

摘 要： 對兩種不同質地類型甜瓜果實發(fā)育過程中果肉質地的變化及相關酶活性進行研究。結果表明，花后35～40 d為軟、脆兩種甜瓜質地形成的關鍵時期。在該時期，軟肉型甜瓜‘NSL細胞面積與間隙增大，果肉細胞排列疏松，細胞面積為脆肉型甜瓜的115.35%，軟肉型甜瓜‘NSL與脆肉型甜瓜‘XZM質構參數(shù)差異顯著，脆肉型甜瓜果實4種細胞壁酶活性總體低于軟肉型甜瓜?；ê?5 d，軟肉型甜瓜‘NSL細胞壁擴展酶基因（CmEXP3、CmEXP5、CmEXP9）相對表達量為最大值，顯著高于脆肉型甜瓜‘XZM。

關鍵詞： 甜瓜;細胞形態(tài);質地剖面分析;細胞壁酶;基因表達

中圖分類號：S652? ? 文獻標志碼：A? ? 文章編號：1673-2871（2020）05-012-06

Abstract： In this experiment， the changes of flesh texture and related enzyme activities during the development of two different texture types of melon fruits were studied. The results have shown that 35-40 d after pollination is the key period for the formation of soft and crisp melon texture. During this period， the cell area and intercellular space of the soft melon increased， and the flesh cells arranged loosely. The cell area of soft type fruit was 115.35% of crisp one. The structure parameters were significantly different. The four cell wall enzyme activities of crisp type were generally lower than those of soft one. At 35 days after pollination， the relative expression of the cell wall extension genes（CmEXP3， CmEXP5， CmEXP9） of the soft type ‘NSL was the highest， which was significantly higher than that of the crisp melon ‘XZM.

Key words： Melon; Cell morphology; Texture profile analysis; Cell wall enzyme; Gene expression

甜瓜質地品質是一個綜合性指標，脆度和硬度是其兩大關鍵因子，甜瓜口感因之而有酥脆、梗硬、軟、面[1]的區(qū)別。影響質地的因素有果肉細胞大小，細胞間結合力，細胞構成物的機械強度和細胞的膨壓等[2]，在果實成熟過程中，胞間層細胞壁酶對質地有重要影響[3]。

TPA和穿刺法[4-5]能對甜瓜果實質地進行客觀評價，劉莉[1]等研究表明甜瓜質構參數(shù)與質地相關。形態(tài)學研究表明[6]，果肉細胞的大小是甜瓜果實質地影響因素之一，細胞越小，甜瓜果肉質地越硬[7]，在蘋果、棗等[8-10]研究中有相同結論。在果實軟化過程中對其生理和分子機制也有相關研究[11-12]，細胞壁酶活性增強促進果實軟化[13]。

脆肉型甜瓜是目前育種的方向，筆者研究5個不同甜瓜材料質地差異的內在因素，為脆肉型甜瓜育種及探究甜瓜質地形成的機制提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料

5份試驗材料（表1）均由西北農林科技大學園藝學院選育，試驗于2019年3—6月在陜西省咸陽市楊凌示范區(qū)西瓜試驗示范基地進行。每個處理重復3次，隨機區(qū)組設計，50穴育苗盤育苗，植株2葉1心定植，株距45 cm，行距80 cm，小區(qū)面積4 m2，每小區(qū)20株，按常規(guī)種植方法管理?；ê?5 d開始采樣，隨機采6個果形端正、大小一致且無病蟲害的果實。選擇5種甜瓜材料中口感差異明顯的脆肉型甜瓜材料‘XZM和軟肉型甜瓜材料‘NSL兩種材料探究果實發(fā)育不同時期果肉細胞顯微結構、果肉細胞形態(tài)學參數(shù)、細胞壁擴展酶基因相對表達量的變化，探究包括‘XZM和‘NSL在內的5種甜瓜材料果實發(fā)育不同時期果肉細胞壁酶活性的變化。

1.2 方法

1.2.1 TPA法 參照劉莉[1]等的方法，有改進。沿甜瓜果實赤道橫向切成厚度約1.0 cm的薄片，果實切薄片去皮，去瓤，留下可食用部分果肉，用直徑0.8 cm的打孔器，用力方向為垂直于薄片打孔，將柱狀果肉高度修飾為0.8 cm，置于TA. XT. Plus物性分析儀（英國Stable Micro System公司）的平板上，采用P/75探頭（Φ 75 mm壓板），設置測試參數(shù)條件如下：預壓速度2.0 mm·s-1，下壓速度3.0 mm·s-1，壓后上行速度3.0 mm·s-1，2次壓縮間停頓3.0 s，試樣受壓形變30.0%，觸發(fā)力10.0 g。

1.2.2 穿刺法 參照劉莉[1]等的方法，有改進。果肉取樣方法與 TPA 法一致，樣品采用直徑為1.6 cm的打孔器進行打孔，圓柱厚度約為2.0 cm。將果肉置于物性分析儀的測試平板上，采用 P/2 探頭（Φ 2 mm 不銹鋼圓柱探頭），測試參數(shù)設置如下：預壓速度5.0 mm·s-1，下行速度 2.0 mm·s-1，穿刺后上行速度2.0 mm·s-1，下壓距離為10.0 mm，觸發(fā)力10.0 g。

1.2.3 果肉細胞顯微結構觀察 將新鮮組織用固定液固定24 h以上，依次梯度酒精進行脫水，將浸好蠟的組織于包埋機內進行包埋，修整好的蠟塊置于石蠟切片機切片，厚4 μm，石蠟切片脫蠟至水，最后將植物組織切片放入染液約2～5 min后水洗，鏡檢。

1.2.4 細胞壁酶活性的測定 酶液的提取參照曹建康等[14]的方法，有改進。PG（多聚半乳糖醛酸酶）活性（以鮮質量計，后同）及Cx（纖維素酶）活性用DNS（3，5-二硝基水楊酸）比色法[15]測定;β-Gal（β-半乳糖苷酶）活性用硝基半乳糖苷水解法[16-17]測定;PME（果膠甲酯酶）活性參照曾秀麗等[18]及張娟等[19]的方法測定。

1.2.5 細胞壁擴展酶基因表達的實時熒光定量 PCR檢測 采用TaKaRa多糖多酚試劑盒提取果肉總RNA（有改進），所提取的總RNA于UV-1700紫外分光光度計測定 A260、A280、A230，1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA質量和完整性。采用 Primer 5.0軟件進行qRT-PCR引物設計，引物序列如表2。使用TaKaRa 逆轉錄試劑盒進行cDNA第一鏈的合成，RNA模板量為1 000 ng。PCR反應總體積10.0 μL，其中包括2.0 μL模板（cDNA），0.2 μL特異引物，5.0 μL SYBR? Premix Ex TaqTM（2×），2.6 μL ddH2O補齊。PCR程序為，94 ℃ 3 min，94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)，每個樣品設置3次重復，引物序列如表2。

1.2.6 數(shù)據統(tǒng)計分析 使用Image-pro plus 6.0軟件對果肉組織切片進行圖像分析，獲得細胞形態(tài)學相關參數(shù);使用SPSS 22.0軟件對質地參數(shù)及細胞形態(tài)參數(shù)等數(shù)據進行統(tǒng)計分析;使用Excel 2010作圖。

2 結果與分析

2.1 兩種質地甜瓜發(fā)育過程中細胞形態(tài)學觀察

在甜瓜發(fā)育不同時期，不同類型甜瓜的細胞大小、排列方式存在差異，在甜瓜果實發(fā)育時期細胞增大（圖1）。花后15 d到25 d，‘NSL果肉細胞小，細胞排列緊密，褶皺多，隨著果實發(fā)育成熟，細胞增大，相同視野下細胞數(shù)量減少，細胞褶皺減少，細胞間隙增大，細胞排列疏松。成熟期軟肉型甜瓜‘NSL的細胞比酥脆型果肉甜瓜‘XZM的大，且排列整齊不一，較疏松，細胞間隙較大，‘XZM細胞較圓，細胞壁褶皺較少。軟肉型甜瓜‘NSL花后40 d細胞大小和間隙增大，排列疏松。綜上所述，甜瓜果肉的質地受細胞形態(tài)、排列方式的影響。

2.2 兩種質地甜瓜發(fā)育過程中的細胞形態(tài)相關參數(shù)的變化

不同細胞形態(tài)學參數(shù)在果實發(fā)育不同時期變化趨勢不同（表3）。細胞形態(tài)參數(shù)變化趨勢無細胞大小參數(shù)明顯，花后40 d，軟肉型甜瓜材料‘NSL與酥脆型甜瓜材料‘XZM細胞大小和細胞形態(tài)等6個細胞相關參數(shù)差異均顯著，兩種材料細胞長度總體呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，花后35～40 d，‘NSL細胞大小的增長趨勢高于‘XZM，細胞圓度總體呈逐漸減小的趨勢，縱橫比呈逐漸增大的趨勢。

2.3 兩種質地甜瓜發(fā)育過程中質構參數(shù)的變化

甜瓜果實發(fā)育不同時期不同口感材料其質構參數(shù)變化不同（表4）。脆肉型材料‘XZM果實發(fā)育各個時期變化不明顯，軟肉型材料TPA硬度呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，花后35～40 d的下降趨勢明顯，花后40 d為最小值358.96 g，與‘XZM差異顯著?；ê?0 d，‘NSL的咀嚼性與‘XZM差異顯著，‘NSL的咀嚼性為各個時期的最小值（64.53 g），‘XZM是其9.84倍?；ê?5 d，‘XZM的黏附力與各個時期差異顯著。‘XZM的穿刺硬度呈先升高后降低的趨勢，‘NSL的穿刺硬度呈下降趨勢。

2.4 甜瓜果實發(fā)育過程中果肉細胞壁酶活性的變化

由圖2可知，不同口感類型甜瓜在發(fā)育、成熟不同時期，細胞壁酶活性有所不同，同一材料甜瓜在發(fā)育、成熟不同時期，質地相關酶酶活性不同。PG活性在甜瓜花后15～35 d，其變化規(guī)律不明顯，在花后35～40 d，5種材料PG活性均呈上升趨勢，且軟肉型甜瓜比脆肉型甜瓜的上升趨勢明顯。Cx活性在花后15～35 d總體呈逐漸上升趨勢，花后35～40 d呈下降趨勢，且軟肉型甜瓜的下降趨勢比脆肉型甜瓜的明顯。β-Gal活性在軟肉型甜瓜中總體呈上升趨勢，花后30 d起，上升趨勢增大，在脆肉型甜瓜，花后15～20 d呈上升趨勢，花后20～40 d呈下降趨勢。PME活性在軟肉型甜瓜中呈逐漸下降趨勢，且軟肉型甜瓜中的PME活性在花后15～40 d的任一時期均比脆肉型的高，脆肉型甜瓜PME活性呈先升高后下降的趨勢，花后15～20 d呈上升趨勢，20～40 d呈下降趨勢。以上結果表明，果實質地的變化受多種酶共同影響，不同細胞壁酶在果實發(fā)育成熟不同時期發(fā)揮作用。

2.5 細胞壁擴展酶基因的表達分析

由圖3可知，CmEXP3、CmEXP5、CmEXP9的相對表達量在‘XZM和‘NSL果實發(fā)育、成熟不同時期均高于CmEXP6，花后35 d的相對表達量增加，與各時期差異顯著。CmEXP3、CmEXP9的相對表達量在脆肉型甜瓜材料‘XZM中總體呈先升高后降低的趨勢，花后25 d相對表達量降低?；ê?5 d，‘NSL的CmEXP3、CmEXP9的相對表達量呈先升高后降低的趨勢，花后35 d達到最大值，分別為花后15 d的17.8倍和7.94倍，花后40 d的表達量下降，但相對表達量均高于花后35 d前的各個時期，且相對表達量均高于 ‘XZM。CmEXP5的相對表達量在花后35 d顯著增加，達到最大值，為花后15 d的2.74倍。CmEXP6的相對表達量在兩材料各個時期的相對表達量較低，總體呈下降趨勢。綜上所述，花后35 d為細胞壁擴展酶基因表達的關鍵時期。

3 討論與結論

筆者對脆肉型甜瓜材料‘XZM和軟肉型甜瓜材料‘NSL果實發(fā)育不同時期的果肉細胞顯微結構、果肉細胞形態(tài)學參數(shù)進行了研究?；ê?5～25 d，細胞增大較為明顯，該時期為甜瓜果實細胞壁物質積累時期。軟肉型甜瓜花后40 d細胞大小和間隙增大，排列疏松。甜瓜果肉的質地受到細胞形態(tài)、排列方式的影響，這與李三培等[7]在甜瓜上的研究結果一致?？墒褂脪呙桦婄R對果肉組織自然斷裂面觀察，進一步研究‘XZM和‘NSL的果肉組織自然斷裂模式對甜瓜質地的影響。通過質構剖面分析測定花后15～40 d每隔5 d各個時期的質構參數(shù)變化，花后35～40 d為軟肉型甜瓜質構參數(shù)變化的關鍵時期。

對口感不同的甜瓜材料細胞壁酶活性的研究結果表明，果實質地的變化受多種酶共同影響，不同細胞壁酶在果實發(fā)育、成熟不同時期發(fā)揮作用，可進一步探究甜瓜質地形成過程中的關鍵酶。張娟等[19]在蘋果中研究表明，PG和PME是‘秦冠果實質地變化的關鍵酶，而β-Gal在‘富士質地變化中發(fā)揮關鍵作用。細胞壁擴展酶基因表達量變化研究表明，甜瓜質地的形成受多個細胞壁擴展酶基因共同調控，花后35 d為細胞壁擴展酶基因表達的關鍵時期，這與果實質構或許在其發(fā)育階段就已經被決定了[21]的研究結果一致。

筆者研究發(fā)現(xiàn)，花后35～40 d為甜瓜質地形成的關鍵時期，可以從質地差異形成生理、分子機制方面對這一時期深入研究。甜瓜種質資源豐富[22]，口感質地多樣，筆者取材感官上有區(qū)別的軟肉和脆肉材料，二者之間細胞壁相關酶活性分析未見顯著差異，因此對甜瓜質地研究還需從感官評價、質構等方面進行綜合評價。

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