孫麗香

(廈門泓益檢測有限公司，福建 廈門 361100)

利巴韋林是嘌呤核苷類似物，是廣譜類強效抗病毒藥物，對DNA病毒和RNA病毒均有抑制復制的作用[1]，臨床上主要用于病毒感染、單純皰疹、麻疹、腮腺炎、水痘、帶狀皰疹等疾病的治療。同時曾廣泛應用于畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，用于預防和治療禽畜類的病毒性疾病[2]。但是利巴韋林具有一定的毒副作用，長期違規(guī)使用可使病毒產(chǎn)生耐藥，誘導耐藥病毒的出現(xiàn)，影響人類病毒疾病的防治。并且利巴韋林具有遺傳毒性、生殖毒性和致癌性等，可引起人體變態(tài)反應和造血系統(tǒng)功能障礙[3]。美國食品藥物管理局(Food and Drug Administation，F(xiàn)DA)早于2005年就禁止將人類抗病毒藥物用于畜禽類[4]；而我國農(nóng)業(yè)部公告第560號中也明確規(guī)定抗病毒類藥物為禁用獸藥[5]。但是仍有部分獸藥企業(yè)違規(guī)生產(chǎn)，養(yǎng)殖業(yè)過量添加，從而導致利巴韋林藥物在動源性食品中殘留，危害人類健康[6]。如2012年“速成雞”事件，養(yǎng)殖企業(yè)非法使用利巴韋林等違禁藥物帶來的食品安全問題，引起人們的普遍關注[7]。

目前國內(nèi)外，檢測利巴韋林的方法主要有免疫放射法[8]，氣相色譜-質(zhì)譜法[9]、液相色譜法[10-14]、液相色譜-質(zhì)譜法[15-20]等。關于發(fā)布的利巴韋林殘留量的測定方法只有兩個標準：SN/T 4519-2016 和DB32/T 1165-2007。本文分析了用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法測定禽肉中利巴韋林測量結果的不確定度來源，對其進行分析和評定，從而給出利巴韋林測量結果的不確定度，以評估液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法測定利巴韋林方法的可靠性及測定結果的可信度。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

甲醇(色譜純)，美國天地；乙腈(色譜純)，美國天地；乙酸銨(優(yōu)級純)，上海安譜；甲酸(優(yōu)級純)，上海安譜；三氯乙酸(分析純)，國藥集團；氨水(分析純)，國藥集團；PBA苯硼酸固相萃取小柱(100 mg/3 mL)，上海安譜；酸性磷酸酯酶，上海安譜；利巴韋林標準品(純度97.5%)，上海安譜；利巴韋林-13C5標準品(純度98%)，TRC；實驗室超純水。

1.2 儀器與設備

液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(配有電噴霧離子源)，賽默飛世爾科技公司；渦旋混勻器，上海精科實業(yè)有限公司；高速冷凍離心機，上海菲恰爾分析儀器有限公司；pH計，賽多利斯；固相萃取裝置、上海安譜氮吹儀，上海安譜；MS204S 電子天平，梅特勒托利多； XS105 電子天平，梅特勒托利多。

1.3 方 法

1.3.1 實驗方法

1.3.1.1 標曲的配制

準確稱量利巴韋林和利巴韋林-13C5標準品(精確至0.01 mg)配制成濃度分別為1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL的工作液，內(nèi)標利巴韋林-13C5濃度為10.0 ng/mL的標準工作液。

1.3.1.2 樣品的制備

稱取雞肉樣品5 g(精確至0.01 g)于50 mL具塞離心管中，加入1 μg/mL利巴韋林-13C5內(nèi)標工作液50 μL，再加入12 mL三氯乙酸溶液和2.5 mL乙腈，超聲10 min，離心后提取上清液。再加入10 mL三氯乙酸溶液重復提取一次，離心后合并上清液定容至25 mL。準確移取5 mL上清液，加入1.0 mL乙酸銨溶液和100 μL酸性磷酸脂酶于37 ℃恒溫干燥箱中酶解2 h。取出后冷卻至室溫，用氨水調(diào)pH值至8.5±0.1，混勻離心，取上清液經(jīng)PBA固相萃取柱中凈化，在45 ℃氮氣吹干，最后用1 mL乙腈-水溶液(體積比90:10)溶解殘渣，過0.22 μm濾膜，供液質(zhì)聯(lián)用儀測定。

1.3.1.3 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-Aq柱(3.0×100 mm，1.8 μm)或相當者；

流動相：A：0.2%甲酸水溶液(3.18)；B：乙腈(3.1)，洗脫程序見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序Table 1 Liquid chromatography gradient elution procedure

流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

ESI正離子模式；多反應檢測(SRM)；毛細管電壓：3800 kV；離子傳輸管溫度：300 ℃。

表2 利巴韋林保留時間、定性定量離子對及碰撞能量Table 2 Retention time, qualitative and quantitative ion pairs and collision energy of the Ribavirin

2 數(shù)學模型建立

樣品中利巴韋林含量計算公式如下：

式中：X——樣品中利巴韋林含量，μg/kg

A——樣品中利巴韋林的峰面積

c——標準溶液中利巴韋林的濃度，ng/mL

ci——樣品中內(nèi)標物利巴韋林-13C5的濃度，ng/mL

Asi——標準溶液中利巴韋林-13C5的峰面積

csi——標準溶液中內(nèi)標物利巴韋林-13C5的濃度，ng/mL

Ai———樣品中內(nèi)標物利巴韋林-13C5的峰面積

As———標準溶液中利巴韋林的峰面積

V———樣品的最終定容體積，mL

m———最終樣品測定液中代表的試樣質(zhì)量，g

df———稀釋倍數(shù)

采用內(nèi)標法實驗，可將上述公式簡化為:

3 分析不確定度來源

通過測試方法及數(shù)學模型，其不確定度的主要來源有：配制標準曲線過程產(chǎn)生的不確定度μrel(C)，樣品稱量產(chǎn)生的不確定度μrel(m)，校準曲線擬合過程產(chǎn)生的不確定度μrel(X0)，前處理過程中定容體積產(chǎn)生的不確定度μrel(V)，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀定量校準引入的不確定度μrel(Y)，重復實驗性產(chǎn)生的不確定度μrel(frep)。各參數(shù)間影響相互獨立，因此其相對合成標準不確定度μrel(X)為：

4 不確定度各分量的計算

4.1 試樣測試過程中由重復性引入的不確定度

在雞肉樣品中加標，按同一前處理條件重復測定6次，測定結果見表3。

表3 樣品中利巴韋林測定結果Table 3 Results of determination of ribavirin in samples

因此，由測量重復性引入的相對標準不確定度為：

4.2 試樣稱量時產(chǎn)生的不確定度

準確稱量雞肉樣品5.00 g(精確至0.01 g)，按均勻分布考慮，則稱量試樣產(chǎn)生的相對標準不確定度為：

4.3 前處理過程中定容體積引入的不確定度

4.4 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀定量校準引入的不確定度

根據(jù)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀的校準報告給出的擴展不確定度μrel=7%，K=2，因此，其產(chǎn)生的相對標準不確定度為：

μrel(Y)=0.07/2=0.035

4.5 標準曲線配制過程產(chǎn)生的不確定度

4.5.1 配制標準儲備液產(chǎn)生的相對標準不確定度

(1)利巴韋林和利巴韋林-13C5標準品證書給出純度分別為99.9%和98.9%，由標準品純度引入的不確定度為：

(2)稱取標準品利巴韋林和利巴韋林-13C5均是10.00 mg，天平允許的最大誤差為±0.01 mg，取矩形分布，相對標準不確定度為：

(4)合成的標準儲備液配制的相對標準不確定度為：

=0.00649

4.5.2 配制標準中間稀釋液所產(chǎn)生的相對標準不確定度

=0.00476

4.5.3 由標準中間液稀釋配制標準工作液所產(chǎn)生的相對標準不確定度

配制標準工作液的過程中主要是由移液器和玻璃量器帶入的不確定度，假設移液槍和容量瓶分別符合均勻分布和三角分布，則10、20、50、100、200 μL移液槍和10 mL A級容量瓶所產(chǎn)生的不確定度如表4所示。

表4 標準工作液所產(chǎn)生的不確定度Table 4 The uncertainty of the produces standard working solution preparation

由于配制利巴韋林標準溶液使用 10 mL容量瓶在配制過程中使用了5次，10、20、50、100、200 μL移液槍在各使用了1次，并且配制利巴韋林-13C5溶液使用100 μL移液槍使用了5次，因此配制工作液產(chǎn)生的合成相對標準不確定度為：

=0.0620

利巴韋林標準曲線配制過程所產(chǎn)生的相對標準不確定度為：

4.6 利巴韋林標準曲線擬合過程產(chǎn)生的不確定度

本實驗中，分別配制了利巴韋林1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL的標準曲線，其中內(nèi)標物利巴韋林-13C5濃度均為10 ng/mL，用最小二乘法擬合，可得標曲的曲線方程為Y=aC+b，見表5。

表5 利巴韋林的測定結果及擬合方程Table 5 Ribavirin determination results and fitting equations

其中，a=0.1025，b=0.0026，R2=0.999。

并且對于同一試樣，平行測定6次，其試樣的平均濃度為4.997 μg/mL(轉(zhuǎn)化為5.00 μg/kg)，則校準曲線擬合引入的相對標準不確定度μrel(C0)可由以下公式計算得到：

式中：a——擬合曲線斜率

p——樣液測定的次數(shù)

m——利巴韋林標準溶液濃度測定的次數(shù)

n——利巴韋林標準溶液濃度點數(shù)

SY——擬合曲線標準偏差

Sc——擬合曲線各濃度的離均差平方和

Yij——各濃度點的響應值

Yi——由擬合曲線計算所得的響應值

Ci——標準曲線中利巴韋林各點濃度值

C0——樣液中利巴韋林的平均濃度

由以上公式計算的結果見表6。

表6 最小二乘法擬合標準曲線產(chǎn)生的相對標準不確定度μrel(C0)Table 6 The unicertaintyμrel(C0) of least square curve fitting

5 樣品合成標準不確定度、擴展不確定度

樣品中利巴韋林的經(jīng)各個不確定分度合成，即可得到其相對不確定：

=0.0749

合成標準不確定度：μ(X)=μrel(X)×X=0.0749×4.997 μg/kg=0.374 μg/kg，取包含因子k=2，置信概率95%，則擴展不確定度為：U(X)=2×0.374 μg/kg=0.748 μg/kg。

6 結 論

本實驗采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞肉樣品中的利巴韋林，得出當k=2(置信度是95%)時，利巴韋林的不確定度可表示為(5.00±0.748)μg/kg，k=2。根據(jù)各個不確定的數(shù)值大小，可知此方法的主要不確定來源于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，標準溶液的配制及校準曲線的擬合。因此，在做該項目的測試工作中，可以從以下幾個方面降低其不確定度：(1)儀器需定期維護保養(yǎng)及校準；(2)標準品溶液的配制過程，操作要規(guī)范，或者盡可能采用精度更高的分度吸量管來配制溶液的標準曲線；(3)提高樣品的均勻性及增加樣品的測定次數(shù)。