李凱澤 陳建英

(廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院心內科，湛江市 524000，電子郵箱：370597780@qq.com)

【提要】 肺動脈高壓是一種難治的、嚴重的并呈進行性發(fā)展的心肺疾病，其表現(xiàn)為肺血管重構、免疫炎癥失調和線粒體代謝功能紊亂等一系列問題，并可能涉及微小RNA的改變，可導致右心室后負荷加重，進而引起右心衰竭，最終導致死亡。大部分藥物對肺動脈高壓的治療效果并不理想，多數(shù)患者預后差。外泌體是一種信號交流介質，在肺組織細胞間的信號交流中有著不可或缺的作用。越來越多的證據(jù)表明外泌體能改善免疫炎癥水平、調節(jié)線粒體代謝功能及抑制肺血管重構，從而改善肺動脈高壓。本文就外泌體的生物特性及其在肺動脈高壓中應用的研究進展進行綜述。

肺動脈高壓是由肺血管重構導致的罕見的慢性發(fā)展的嚴重心肺疾病，可導致右心衰竭和死亡。其主要病理特征包含肺動脈平滑肌和內皮細胞的增殖及抗凋亡，細胞外基質的產生和沉積，促炎細胞因子和趨化細胞因子的聚集以及白細胞在肺血管周圍區(qū)域的浸潤[1]。肺動脈高壓定義為靜息狀態(tài)下平均肺動脈壓25 mmHg或以上，或運動狀態(tài)下平均肺動脈壓30 mmHg或以上[2]。據(jù)統(tǒng)計，全球每年有4萬余人患肺動脈高壓，且病死率高達15%[3]。肺動脈高壓患者即使經過正規(guī)治療，3年存活率也僅為55%～65%，目前市面上的藥物對肺動脈高壓的療效并不十分理想，大多數(shù)患者預后并不好，生活質量改善不明顯，并且藥物費用昂貴，常伴有明顯的副作用[4]。因此，臨床上急需一種新的能夠治愈或控制肺動脈高壓發(fā)展的藥物。研究表明外泌體能改善肺動脈高壓[5]，外泌體的出現(xiàn)給肺動脈高壓患者帶來了曙光。本文就外泌體的生物特性及其在肺動脈高壓中應用的研究進展進行綜述。

1 外泌體的生物特性

外泌體是30～100 nm的單膜小囊泡，具有雙分子磷脂結構。外泌體包含41 860種蛋白質，超過7 540種RNA和1 116種脂質分子，還包含特定的糖綴合物以及與膜相關的高級寡聚蛋白復合物[6]。外泌體在不同生物狀態(tài)下及其形成階段中，形態(tài)、大小甚至所含內容物都會有所不同。一般來說，外泌體的內容物會因其不同來源而不同。此外，外泌體攜帶重要的通信息分子，如脂筏(鞘脂和膽固醇)、蛋白質(四跨膜蛋白、黏附分子和其他一些成分)以及一些遺傳成分(包括DNA和非編碼的RNA)，在細胞之間的信號通信中有著不可替代的作用[7]。

1.1 外泌體來源與形成 細胞膜內部出芽，形成早期內體；早期內體在高爾基體內作用，產生晚期內體；晚期內體膜內陷，混雜高爾基體和細胞核的蛋白質，形成腔內囊泡[8]；腔內囊泡與溶酶體融合或與細胞膜融合后降解，再從細胞膜分泌出來，形成細胞外囊泡。根據(jù)粒徑及細胞內來源不同，細胞外囊泡可分三類：微泡(50 nm～1 μm)，外泌體(30～150 nm)和凋亡小體(50 nm～5 μm)[9]。外泌體不只是在哺乳動物細胞分泌，原生生物、真菌和植物同樣也可分泌外泌體[10]。幾乎所有哺乳動物的細胞都會產生外泌體，包括心肌細胞、內皮細胞、心臟成纖維細胞、干細胞等[11]。

1.2 外泌體提取和鑒定 伴隨生物醫(yī)學產業(yè)的高速發(fā)展，外泌體作為新型的生物材料，具有極其重要的研究價值，因此需要分離提純。目前常用的分離技術包括超高速離心技術、基于尺寸的分離技術、聚合物沉淀技術、免疫親和捕獲技術以及微流體衍生芯片分離技術[11]。前三者是最常使用的外泌體分離技術[12]，而超高速離心技術又是使用最廣泛的分離技術。但是最有發(fā)展前景的分離技術為微流體衍生芯片分離技術，該技術能在微觀尺度下把控外泌體的生物化學及物理特征的差別，如密度、大小和免疫親和力[13]。Tauro等[14]采用超高速離心技術、密度梯度分離和免疫親和捕獲技術分離人類結腸癌細胞系LIM1863衍生的外泌體 ，結果表明免疫親和捕獲技術分離出來的外泌體結構更完整。Gheinani等[15]對超高速離心技術和尺寸排阻色譜方法進行改良后，每次分離的外泌體大小都在50～150 nm之間。外泌體組分復雜，提取分離技術繁雜，因此有必要對外泌體進行鑒定。迄今為止，外泌體的鑒定技術有以下幾種：蛋白質印跡、胰蛋白酶消化、流式細胞術、質譜和酶聯(lián)免疫吸附測定分析[16]。Chen等[17]認為鑒定外泌體時，先用動態(tài)光散射技術分析外泌體大小，再用透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài)，最后用蛋白質印跡法檢測外泌體成分。

1.3 外泌體的潛能 外泌體可直接作用于靶點，對疾病進行干預。Wang等[18]發(fā)現(xiàn)在人骨髓間充質干細胞中提取的外泌體，過表達微小RNA(microRNA，miRNA)-34a可介導MYCN基因表達下調，從而延緩膠質母細胞瘤的疾病進展。外泌體可作為載體運輸藥物，對疾病進行治療。幼稚巨噬細胞衍生的外泌體可以穿過血腦屏障，將腦源性神經營養(yǎng)因子的載體蛋白運輸至腦，從而治療腦炎[19]。此外，外泌體還可以作為疾病診斷及判斷預后的標志物。研究表明，外泌體來源的胎兒循環(huán)DNA有可能成為判斷妊娠并發(fā)癥預后的生物標志物，并有可能解釋各種妊娠并發(fā)癥的發(fā)病機制[20]。而尿外泌體miRNA-30c-5p可靶向調控熱休克蛋白A5的表達來阻止腎透明細胞癌的發(fā)展，且miRNA-30c-5p能夠穩(wěn)定擴增并在腎透明細胞癌中有表達特異性，可成為早期腎透明細胞癌潛在的診斷生物標志物[21]。

2 外泌體和肺動脈高壓

2.1 外泌體對肺動脈高壓線粒體的影響 線粒體是細胞進行氧化代謝的主要場所，是營養(yǎng)物質最終氧化釋放能量的場所，線粒體正常工作時會出現(xiàn)膜電位。在發(fā)生缺氧性肺動脈高壓時，線粒體功能障礙可促進內皮損傷，并導致膜電位增加[22]。在缺氧誘導肺動脈高壓大鼠模型中，線粒體功能障礙并導致膜電位增加，進而調節(jié)線粒體Ca2+內流，從而影響血管平滑肌細胞增殖[23]。上述研究表明發(fā)生肺動脈高壓時存在線粒體功能障礙。線粒體產生三磷酸腺苷的過程中會產生副產物氧自由基，雖然線粒體存在抗氧化劑，但是過量的氧自由基依然會對線粒體蛋白質、線粒體DNA及線粒體膜造成損害[24]，導致線粒體產生三磷酸腺苷及活性氧的效率降低。活性氧的減少，可抑制細胞氧化還原狀態(tài)，導致細胞出現(xiàn)一個偽缺氧環(huán)境，引起缺氧誘導因子1常氧活化[25]，從而下調丙酮酸脫氫酶和谷氨酸脫氫酶1的表達[26]。而外泌體可通過抑制上游抑制劑Sirtuin 4的表達，上調丙酮酸脫氫酶和谷氨酸脫氫酶1的表達，從而改善肺動脈高壓的線粒體功能[27]。上述研究表明外泌體可通過恢復線粒體功能，改善肺動脈高壓。

2.2 外泌體對肺動脈高壓免疫炎癥的影響 炎癥細胞可導致血管內皮細胞凋亡和血管平滑肌增殖，免疫細胞募集，產生正反饋效應，引起血管重構，促進肺動脈高壓發(fā)展[28-29]。在特發(fā)性肺動脈患者中，免疫炎癥因子如白細胞介素(interleukin， IL)-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、腫瘤壞死因子α和單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)水平明顯升高，預示其病情預后不良，導致死亡率升高[30]。與正常健康小鼠對比，在缺氧誘導的肺動脈高壓小鼠模型中，MCP-1水平顯著增加，并與巨噬細胞極化和肺血管重構密切相關[31]。IL-6水平在肺動脈高壓患者中明顯升高，并激活信號轉導與轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)，促進外周細胞遷移及血管重構[32]。巨噬細胞參與肺動脈高壓的發(fā)病，并分泌天冬酰胺內肽酶，激活基質金屬蛋白酶2和轉化生長因子β1的信號傳導通路，從而促進疾病發(fā)展[33]。而在低氧性誘導的肺動脈高壓小鼠模型中，外泌體能抑制STAT3通路，降低IL-6、MCP-1水平，減少巨噬細胞聚集，從而改善肺動脈高壓[34]。外泌體通過let-7b上調抗炎因子水平及促進M2巨噬細胞活化，從而調節(jié)巨噬細胞功能[35]。間充質干細胞來源的外泌體通過調節(jié)巨噬細胞表型，改善肺功能，減少肺纖維化和肺動脈重構，從而改善肺動脈高壓[36]。以上研究表明外泌體可通過調節(jié)免疫炎癥因子水平，改善肺動脈高壓。

2.3 外泌體對肺動脈高壓miRNA的影響 肺動脈高壓是一種進行性破壞的嚴重疾病，盡管學者們不斷開發(fā)新的療法，但是臨床獲益有限，因此迫切需要闡明肺動脈高壓的發(fā)病機制。據(jù)報道，肺動脈高壓的發(fā)病機制涉及miRNA失調，修正miRNA失調能逆轉肺動脈高壓[37]。重度肺動脈高壓患者的血管中miRNA-204表達減少；血管緊張素Ⅱ和內皮素-1可以下調miRNA-204表達水平，激活STAT3通路，促進肺動脈平滑肌細胞增殖和凋亡抵抗，引起血管重構[38]。外泌體可改善肺動脈平滑肌細胞增殖和細胞凋亡抗性[39]，從而改善肺動脈血管重構。Aliotta等[40]發(fā)現(xiàn)從野百合堿誘導的肺動脈高壓小鼠的血漿或肺中分離的外泌體，可以誘導健康小鼠中右心室/左心室+室間隔比率增加，而從骨髓干細胞分離的外泌體可以預防和逆轉野百合堿誘導的肺動脈高壓，因而可逆轉右心室肥大和肺血管重構。表明外泌體在肺動脈高壓小鼠模型中對調節(jié)肺高血壓反應起關鍵作用。間充質基質細胞衍生的外泌體可抑制STAT3的激活，上調肺組織內的miRNA-204水平，對肺發(fā)揮多效保護作用，從而抑制肺動脈高壓的發(fā)展[34]。間充質干細胞衍生的外泌體可通過抑制肌球蛋白1e將miRNA-125b轉移至血管平滑肌細胞，從而逆轉肺動脈血管重構[41]。這些研究表明外泌體可通過調節(jié)miRNA水平，逆轉肺動脈血管重構，進而改善肺動脈高壓。

2.4 外泌體對肺動脈高壓相關基因的影響 發(fā)生肺動脈高壓最常見的遺傳原因是編碼骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體2(bone morphogenetic protein receptor 2，BMPR2)基因發(fā)生突變。一項納入1550名肺動脈高壓患者的研究中，發(fā)生BMPR2突變的患者有448名(29%)，并且突變攜帶者年齡較小，肺動脈壓力及肺動脈阻力較大但心臟指數(shù)低；與非突變攜帶者相比，突變攜帶者在年輕時易出現(xiàn)更嚴重的疾病及更高的死亡風險[42]。BMPR2表達的減低或功能的失調，將會介導高遷移率蛋白家族A1表達增加，導致肺動脈內皮細胞發(fā)生內皮-間質轉化，促進特發(fā)性肺動脈高壓特征性的閉塞性重構[43]。與非BMPR2突變攜帶者相比，從BMPR2突變攜帶者中可分離出更多由血液生長內皮細胞釋放出的外泌體，而對比微泡，這種來源的外泌體含有更多翻譯調控腫瘤蛋白，而調控腫瘤蛋白是一種能促存活和抗細胞凋亡的物質，并參與肺動脈高壓的肺血管細胞增殖及抗凋亡，外泌體中的翻譯調節(jié)腫瘤蛋白有望成為肺動脈高壓的潛在診斷標志物[44]。脂肪間充質干細胞來源的外泌體中的miRNA-191可調控BMPR2表達水平，進而在肺動脈高壓中發(fā)揮治療作用[45]。由上可見，外泌體不僅可通過miRNA-191來調控BMPR2的表達水平，對BMPR2相關性的肺動脈高壓起保護作用，還有望成為BMPR2相關性肺動脈高壓的潛在診斷標志物。

3 展 望

越來越多的證據(jù)表明外泌體是細胞之間的通訊器，其可將信號傳遞到遠處靶點，發(fā)揮治療疾病或預測疾病進展的功能。與干細胞不同，外泌體具有較高的生物相容性。此外，外泌體具有抗性膜，具有較長的自我生存期，利于長期儲存，這是外泌體運用于臨床治療肺動脈高壓的一個有利條件。外泌體可為治療或干預肺動脈高壓提供新思路。然而，目前外泌體在肺動脈高壓中的應用尚處于初期階段，分離純化、生物異質性以及自身大小等都是亟待解決的問題，全面了解外泌體的功能和作用機制，仍然是臨床上的巨大挑戰(zhàn)。