樊 麗 許景偉 王曉鑫 趙雪松 陳宏月

(1 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥科學(xué)研究院，黑龍江省齊齊哈爾市 161006，電子郵箱：fan123456li@126.com；2 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院普通外科，黑龍江省齊齊哈爾市 161041)

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌及頭頸部惡性腫瘤，約占內(nèi)分泌相關(guān)惡性腫瘤的 95%，其發(fā)病率在女性惡性腫瘤中位于的第5位[1]。未分化甲狀腺癌雖然只占甲狀腺癌的2%左右，但其惡性度高、進(jìn)展快，預(yù)后極差，常規(guī)抗腫瘤治療方法效果甚微，且多數(shù)患者確診時已處于晚期，伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，部分患者生存期僅半年左右，5年生存率低于10%[2-4]。斑蝥屬鞘翅目，蕪菁科昆蟲，斑蝥素是從斑蝥體內(nèi)提取出來的一種半萜烯毒素，具有較好的抗腫瘤作用[5-6]。但由于其具有較強(qiáng)的毒副作用，尤其對消化系統(tǒng)及泌尿系統(tǒng)的毒性較大，限制了其臨床應(yīng)用。改造斑蝥素的結(jié)構(gòu)，降低其毒副作用，已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。去甲斑蝥素(norcantharidin，NCTD)是我國首先研發(fā)的抗腫瘤藥物，由斑蝥素脫去1,2位甲基制成，保留了其抗腫瘤活性的同時，減少了毒副作用[7]。目前鮮見有關(guān)NCTD抑制未分化甲狀腺癌細(xì)胞增殖的研究。本研究以NCTD處理人未分化甲狀腺癌 FRO 細(xì)胞，觀察其對 FRO 細(xì)胞增殖的抑制作用，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源與主要試劑 甲狀腺癌細(xì)胞系FRO細(xì)胞由中科院上海生命研究院提供；NCTD 由貴州金橋藥業(yè)有限公司提供(批號：JRSW170311-1)；杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)培養(yǎng)基由美國Sigma公司提供(批號：8198451)；胎牛血清由美國Gibco公司提供(批號：42G5182K)；細(xì)胞計數(shù)檢測(cell counting kit-8，CCK-8)試劑盒與二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(批號：C0038、ST1276)；M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Invitrogen公司(批號：K1622)；SYBR Green qPCR SuperMix購自美國ABI公司(批號：4368708)；吖啶橙/溴乙啶(acridine orange/ethidium bromide,AO/EB)試劑購自羅萊寶科技有限公司(批號：20171029)；線粒體膜電位檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(批號：022618180620)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組干預(yù)：復(fù)蘇FRO細(xì)胞，并接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長后每2 d換液1次，生長達(dá)到90%孔底面積時經(jīng)胰酶消化傳代。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，分為空白對照組(0 μg/mL組)以及NCTD低、中、高劑量組(10 μg/mL組、20 μg/mL、40 μg/mL組，均采用DMEM配制)，各劑量加入相應(yīng)劑量的 NCTD，空白對照組加入等體積DMEM培養(yǎng)基。

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞活性： 收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，以5 000個/孔加到96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL；于37.0℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞長滿孔底后吸出培養(yǎng)基，分別加入含終濃度為0、5、10、20、40、80 μg/mL的NCTD的培養(yǎng)液100 μL繼續(xù)培養(yǎng)，每個濃度設(shè)5個平行孔，分別于12 h、24 h、48 h取出培養(yǎng)板，加入含10 μL CCK-8溶液的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h，于酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度(A)值。計算細(xì)胞的生長抑制率。抑制率=[(對照孔A-實(shí)驗(yàn)孔A)/(對照孔A-空白孔A)]×100%。

1.2.3 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)：取對數(shù)生長期的細(xì)胞以300個/孔接種于6孔板，每孔2.5 mL。按照1.2.1的方法將細(xì)胞分組干預(yù)后置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3 d換液一次，培養(yǎng)液與初始干預(yù)時所用培養(yǎng)液相同。培養(yǎng)2周后，棄去培養(yǎng)基，用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate-buffered saline，PBS)清洗2次，甲醇固定15 min，PBS清洗3次，用0.1%結(jié)晶紫染色液染色1 h，PBS 洗凈晾干后于顯微鏡下觀察細(xì)胞集落數(shù)量并拍照。以細(xì)胞數(shù)大于50個為1個克隆，克隆形成率=形成克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4 AO/EB實(shí)驗(yàn)：取對數(shù)生長期的細(xì)胞，將細(xì)胞數(shù)調(diào)整至1×105個細(xì)胞/mL，接種于6孔板中培養(yǎng)24 h后，按照1.2.1方法將細(xì)胞分組干預(yù)，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄去上清液，PBS洗滌細(xì)胞，4%多聚甲醛固定10 min，滴加AO與EB等體積混合的染料，激光共聚焦掃描并拍照，觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 實(shí)時定量PCR檢測：檢測B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2 )和Bcl-2 相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)mRNA表達(dá)水平。按照1.2.4方法干預(yù)細(xì)胞24 h后收集各組細(xì)胞，按照試劑盒方法提取總RNA，經(jīng)微量紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度。將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參基因，進(jìn)行實(shí)時定量PCR。按試劑盒說明加入相應(yīng)的反應(yīng)物，反應(yīng)體系總體積為50 μL。反應(yīng)條件為:95℃ 3 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s， 40個循環(huán)。Bcl-2上游引物為GTGACTTCCGATCAGGAAGG，下游引物為CTTCCAGACATTCGGAGACC；Bax上游引物為AGTAACATGGAGCTGCAGAGG，下游引物為ATGGTTCTGATCAGTTCCGG；GAPDH上游引物為AGCCACATGGCTCAGACAC，下游引物為GCCCAATACGACCAAATCC。采用2-△△Ct計算目的基因的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 JC-1法檢測細(xì)胞線粒體膜電位：按照1.2.4方法干預(yù)細(xì)胞24 h后收集各組細(xì)胞。分別加入0.5 mL新鮮DMEM培養(yǎng)基和0.5 mL JC-1染色工作液，充分混勻，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育20 min，1 000 r/min離心5 min棄去上清，用預(yù)冷的JC-1緩沖液洗滌2次，采用美國BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以(x±s)表示，多組樣本間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法進(jìn)行。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NCTD對FRO細(xì)胞增殖的影響 不同濃度NCTD處理FRO細(xì)胞12 h、24 h、48 h后，隨著濃度增大、時間延長，各組細(xì)胞抑制率增加(均P<0.05 )。40 μg/mL組作用24 h后，對FRO細(xì)胞增長抑制率為52.48%，達(dá)到半數(shù)致死率，見表1，故本實(shí)驗(yàn)采用10、20、40μg/mL NCTD作用細(xì)胞24 h進(jìn)行觀察。

表1 不同濃度NCTD干預(yù)后FRO細(xì)胞增殖抑制率(x±s，%)

2.2 NCTD對FRO細(xì)胞克隆形成的影響 0、10、20、40 μg/mL組克隆形成率依次降低(均P<0.05)，克隆集落逐漸變小。見圖1及表2。

圖1 不同濃度NCTD干預(yù)后FRO細(xì)胞克隆形成情況

2.3 NCTD對FRO細(xì)胞凋亡的影響 AO可以進(jìn)入細(xì)胞膜完整的細(xì)胞，與DNA結(jié)合發(fā)出綠色熒光；EB可進(jìn)入破損的細(xì)胞膜，與DNA結(jié)合發(fā)出橙紅色熒光，并可見核固縮及凋亡小體。AO/EB實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0 μg/mL組鏡下可見均一的綠色熒光，核型結(jié)構(gòu)正常；10、20、40 μg/mL組正常細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，凋亡細(xì)胞數(shù)逐漸增多，綠色熒光逐漸轉(zhuǎn)為橙紅色。10 μg/mL組可見核固縮、邊集、新月形等早期凋亡形態(tài)。20 μg/mL和40 μg/mL組可見一些細(xì)胞核發(fā)生碎裂，高度聚集等形態(tài)，核被染色成橘紅色，且40 μg/mL組較20 μg/mL更加明顯。見圖2。

圖2 不同濃度NCTD干預(yù)后FRO細(xì)胞凋亡的情況(×200)

2.4 NCTD對FRO細(xì)胞Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)的影響 0、10、20、40 μg/mL組Bax mRNA相對表達(dá)水平依次升高，Bcl-2 mRNA相對表達(dá)水平依次降低(均P<0.05)，見表2。

表2 不同濃度NCTD干預(yù)后FRO細(xì)胞Bcl-2和Bax mRNA 表達(dá)量、克隆形成率及線粒體膜電位比較(x±s)

注：與0 μg/mL 組比較，aP<0.05；與10 μg/mL組比較， bP<0.05；與20 μg/mL 組比較，cP<0.05。

2.5 NCTD對FRO細(xì)胞線粒體膜電位的影響 右上象限表示JC-1在細(xì)胞內(nèi)以聚合物形式存在，細(xì)胞線粒體膜電位升高，并發(fā)出紅色熒光；右下象限表示JC-1在細(xì)胞內(nèi)以單體形式存在，細(xì)胞線粒體膜電位降低，并發(fā)出綠色熒光。流式細(xì)胞結(jié)果顯示，0、10、20、40 μg/mL組右下象限細(xì)胞比率依次升高，即細(xì)胞線粒體膜電位依次降低(均P<0.05)。見圖3及表2。

圖3 不同濃度NCTD干預(yù)后FRO細(xì)胞線粒體膜電位

3 討 論

近年來甲狀腺癌發(fā)病率呈逐年快速增長趨勢，其中惡性程度最高的是未分化甲狀腺癌，迄今尚無特別有效的治療方法。未分化甲狀腺癌生長迅速，且不可控制，很快累及到周圍組織，如氣管、血管、神經(jīng)和肌肉等，并伴有遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移[4]。斑蝥用于腫瘤治療已有兩千多年的歷史，但由于其毒副作用大，限制了其臨床應(yīng)用。NCTD是我國擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗腫瘤藥物之一，對多種腫瘤治療有效，尤其對消化系統(tǒng)腫瘤效果較好，已成為當(dāng)前抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)[8]。

Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用，主要分布于線粒體外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜中。其中抗凋亡蛋白Bcl-2和促進(jìn)凋亡蛋白 Bax是該家族的主要成員[9]。Bcl-2可以維持線粒體膜電位、鈣離子的動態(tài)平衡，同時抑制線粒體釋放 細(xì)胞色素C和半含胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase) 等凋亡因子，從而發(fā)揮抗凋亡作用。Bax則是最早發(fā)現(xiàn)的促進(jìn)凋亡的蛋白之一。一方面，Bax同源聚合物插入線粒體外膜形成通道，釋放鈣離子，對Bax有協(xié)同作用，可以激活Caspase-9，還可以發(fā)揮對Caspase蛋白酶家族的酶解級聯(lián)激活作用，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；另一方面，Bax與Bcl-2形成異源二聚體，對Bcl-2產(chǎn)生阻抑作用。研究表明，Bax/Bcl-2蛋白比例是決定細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素[10-11]。本研究結(jié)果顯示，NCTD對FRO細(xì)胞的生長抑制作用呈濃度依賴性，且隨著NCTD濃度的增加，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平逐漸降低，Bax mRNA表達(dá)水平逐漸升高；AO/EB實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，與0 μg/mL組比較，其他組細(xì)胞均出現(xiàn)凋亡，且呈濃度依賴性。這提示NCTD可濃度依賴性地抑制FRO細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

線粒體由內(nèi)外雙層膜組成，是促進(jìn)細(xì)胞能量轉(zhuǎn)換、參與細(xì)胞凋亡的重要細(xì)胞器。由于線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的質(zhì)子與其他離子濃度呈不對稱分布，因而形成線粒體膜電位。線粒體膜電位是維持線粒體正常功能的必要條件。研究顯示，線粒體膜電位下降是細(xì)胞凋亡的前提，其變化早于線粒體的形態(tài)變化及DNA 的斷裂等[12-13]。本研究的JC-1實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨NCTD濃度的增加，細(xì)胞線粒體膜電位隨之降低，提示NCTD可能通過線粒體途徑誘導(dǎo)FRO細(xì)胞凋亡。

綜上所述，NCTD可以抑制FRO細(xì)胞增殖，并促進(jìn)其凋亡，且呈濃度依賴性，其相關(guān)機(jī)制可能與降低線粒體膜電位有關(guān)。