武愫斌 李陽(yáng)陽(yáng) 陳浩舟

(1 陜西省商洛市中心醫(yī)院胸外科，商洛市 726000，電子郵箱：vpejv9@163.com；2 商洛職業(yè)技術(shù)學(xué)院護(hù)理系，陜西省商洛市 726000)

食管癌是一種常見(jiàn)的消化道腫瘤，多發(fā)于中老年人群，且男性發(fā)病率高于女性[1]。近年來(lái)隨著環(huán)境及人們飲食結(jié)構(gòu)的改變，食管癌發(fā)病率逐年升高[1-2]。食道癌早期癥狀不明顯，多數(shù)患者就診時(shí)病情已進(jìn)展至中晚期，而中晚期食管癌患者預(yù)后差，生存率極低[3]。因此，積極尋找早期診斷方法，進(jìn)而早發(fā)現(xiàn)、早治療，對(duì)提高食管癌患者生存質(zhì)量具有重要意義。微小RNA(microRNA，miRNA)是一種具有調(diào)控功能的短鏈非編碼RNA。miRNA已被證實(shí)參與細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、凋亡等多種進(jìn)程，與癌癥發(fā)展密切相關(guān)[4]。例如，有研究顯示，miRNA-15b表達(dá)水平在大腸癌患者癌組織中顯著下調(diào)，與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后差有關(guān)[5]；膠質(zhì)瘤組織中miRNA-15b表達(dá)水平明顯低于正常腦組織，上調(diào)miRNA-15b表達(dá)水平可抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞遷移、侵染[6]；miRNA-34c被證實(shí)在宮頸癌組織中呈低水平表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的增殖和分裂有關(guān)[7]；miRNA-34c可抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞活性，而下調(diào)miRNA-34c表達(dá)水平可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和遷移[8]。此外，多項(xiàng)研究顯示miRNA-15b、miRNA-34c均與上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)[9-10]。然而兩者在食管鱗癌中的作用尚不清楚。故本研究通過(guò)檢測(cè)miRNA-15b、miRNA-34c在早期食管癌患者血清中的表達(dá)水平，分析兩者與臨床病理特征的關(guān)系以及兩者對(duì)早期食管癌的診斷價(jià)值，以期為臨床診斷和治療食管癌提供一定理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年12月至2018年12月商洛市中心醫(yī)院收治的早期食管癌患者113例(食管癌組)。其中男性64例、女性49例，年齡28～75(58.67±14.82)歲；原發(fā)腫瘤-區(qū)域淋巴結(jié)-遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(tumor-node-metastasis，TNM)分期[11]Ⅰ期 63例，Ⅱ期50例；高、中分化76例，低分化37例；鱗癌71例，腺癌42例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)臨床表現(xiàn)及組織病理學(xué)檢查確診為食管癌；(2)病灶位于黏膜層及黏膜下層，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，TNM分期[11]為Ⅰ、Ⅱ期的早期食管癌患者；(3)臨床資料完整；(4)患者入組前未進(jìn)行放療或化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他部位腫瘤者；(2)患有嚴(yán)重精神疾病者；(3)心、腎、肝臟功能不全者。另選取同期在商洛市中心醫(yī)院體檢的113例健康者為對(duì)照組。其中男性66例、女性47例，年齡27～76(59.25±15.63)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)平時(shí)身體素質(zhì)較好；(2)體檢時(shí)未發(fā)現(xiàn)患有惡性腫瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有糖尿病、高血壓、冠心病、感染性疾??；(2)肝、腎功能不全；(3)妊娠期、哺乳期婦女。兩組的年齡、性別構(gòu)成比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。研究對(duì)象或家屬均對(duì)本研究知情并簽署知情同意書(shū)。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 主要儀器和試劑 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)儀(美國(guó)ABI公司，型號(hào)：7500 Fast)，miRNA提取試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司，批號(hào)：WE0195-KCU)，miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司，批號(hào)：ALH266-PTO)，qRT-PCR試劑盒(日本TaKaRa公司，批號(hào)：RR420A)。

1.3 檢測(cè)方法 清晨(7：00～9：00)采集研究對(duì)象空腹外周靜脈血5 mL，于4℃下3 000 r/min離心10 min后取上清液分裝于無(wú)菌EP管中，-80℃保存?zhèn)溆?。使用miRNA提取試劑盒提取總RNA，再使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA后。用qRT-PCR試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)，20 μL反應(yīng)體系包括SYBR?Primix Ex TaqTM10 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，cDNA 2 μL，ROX 0.4 μL，無(wú)酶水6.8 μL。具體反應(yīng)步驟：95℃ 30 s，95℃ 5 s，62℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本重復(fù)3次。以U6為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計(jì)算miRNA-15b、miRNA-34c相對(duì)表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 收集資料 收集所有研究對(duì)象的一般資料及病理學(xué)資料。一般資料包括年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)、吸煙史、飲酒史、飲食習(xí)慣等。其中吸煙定義為平均每天吸煙≥1支，連續(xù)或累積≥1年；飲酒定義為平均每周飲酒≥1次，連續(xù)或累積≥1年[12]。病理學(xué)資料包括腫瘤大小、組織學(xué)分型、分化程度及TNM分期等。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以[n(%)]表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；使用Logistic回歸分析影響食管癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素；受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線分析miRNA-15b相對(duì)表達(dá)水平與miRNA-34c相對(duì)表達(dá)水平對(duì)早期食管癌診斷價(jià)值。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組研究對(duì)象一般資料比較 兩組年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)、吸煙及飲酒情況比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。食管癌組喜食腌制食品、燙食者比例高于對(duì)照組，而喜食蔬菜水果者比例低于對(duì)照組(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組研究對(duì)象一般資料對(duì)比

2.2 兩組血清miRNA-15b、miRNA-34c相對(duì)表達(dá)水平 食管癌組患者血清miRNA-15b、miRNA-34c相對(duì)表達(dá)水平均低于對(duì)照組(均P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 兩組研究對(duì)象血清miRNA-15b、miRNA-34c相對(duì)表達(dá)水平比較(x±s)

2.3 血清miRNA-15b、miRNA-34c相對(duì)表達(dá)水平與早期食管癌臨床病理特征的關(guān)系 不同性別、年齡、腫瘤大小、組織學(xué)分型的早期食管癌患者血清miRNA-15b、miRNA-34c相對(duì)表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。低分化早期食管癌患者血清miRNA-15b、miRNA-34c相對(duì)表達(dá)水平低于高、中分化患者(P<0.05)；TNM分期Ⅱ期患者血清miRNA-15b、miRNA-34c相對(duì)表達(dá)水平低于TNM分期Ⅰ期患者(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 不同臨床病理特征早期食管癌患者血清miRNA-15b、miRNA-34c相對(duì)表達(dá)水平比較(x±s)

2.4 早期食管癌發(fā)生的影響因素的Logistic回歸分析 以是否發(fā)生食管癌為因變量(是=1，否=0)，以是否喜食腌制食品(是=1，否=0)、是否喜食燙食(是=1，否=0)、吸煙(是=1，否=0)、飲酒(是=1，否=0)、miRNA-15b相對(duì)表達(dá)水平(≤0.78=1，>0.78=0)、miRNA-34c相對(duì)表達(dá)水平(≤0.69=1，>0.69=0)為自變量，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，喜食燙食、吸煙、飲酒與早期食管癌發(fā)生無(wú)關(guān)(均P>0.05)，而喜食腌制食品、miRNA-15b相對(duì)表達(dá)水平≤0.78、miRNA-34c相對(duì)表達(dá)水平≤0.69是早期食管癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素(均P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 影響早期食管癌發(fā)生的因素的Logistic回歸分析結(jié)果

2.5 血清miRNA-15b相對(duì)表達(dá)水平和miRNA-34c相對(duì)表達(dá)水平對(duì)早期食管癌的診斷效能 血清miRNA-15b診斷早期食管癌的ROC曲線下面積為0.836(P<0.001)，敏感度為89.50%，特異度為72.70%。血清miRNA-34c診斷早期食管癌的ROC曲線下面積為0.804(P<0.001)，敏感度為63.20%，特異度為83.60%。外周血血清miRNA-15b與miRNA-34c聯(lián)合診斷早期食管癌的ROC曲線下面積為0.949(P<0.001)，敏感度為93.00%，特異度為81.80%。miRNA-15b、miRNA-34c聯(lián)合診斷時(shí)ROC曲線下面積大于單一指標(biāo)(z=2.548、P=0.011；z=4.106，P<0.001)。見(jiàn)圖1。

圖1 血清miRNA-15b、miRNA-34c相對(duì)表達(dá)水平及兩者聯(lián)合診斷早期食管癌的ROC曲線

3 討 論

早期食管癌患者吞咽粗硬食物時(shí)有哽噎停滯感，喝水之后可緩解。隨著病情進(jìn)展，食管癌患者出現(xiàn)進(jìn)行性吞咽困難，難以吞咽干硬食物、半流質(zhì)食物甚至水等。中晚期食管癌細(xì)胞易轉(zhuǎn)移至其他部位，造成食管癌患者出現(xiàn)胸背部持續(xù)疼痛、呼吸系統(tǒng)感染、腹腔積液、昏迷甚至死亡[12]。早期有效診斷對(duì)改善食管癌患者治療效果、提高患者生存率和生活質(zhì)量有重要意義。食管癌發(fā)病影響因素有飲食習(xí)慣(如喜食燙食、喜食腌制食物、水果蔬菜攝入不足)、吸煙、飲酒、口腔不潔、遺傳因素等[13]。本研究結(jié)果顯示，食管癌組喜食腌制食品、燙食者比例高于對(duì)照組，而喜食蔬菜水果者比例低于對(duì)照組(P<0.05)，與房廣梅等[14]的研究結(jié)果相似，且Logistic回歸分析結(jié)果也顯示，喜食腌制食品是食管癌發(fā)病的危險(xiǎn)因素。

MacLean等[15]的研究表明，在卵巢癌細(xì)胞中miRNA-15b表達(dá)水平下調(diào)，其低表達(dá)與卵巢癌患者的高臨床分期和低生存率有關(guān)。此外，miRNA-15b過(guò)表達(dá)能抑制口腔舌鱗癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤干細(xì)胞表型，為口腔舌鱗癌治療提供新靶點(diǎn)[9]。本研究結(jié)果顯示，早期食管癌患者血miRNA-15b相對(duì)表達(dá)水平低于健康者(P<0.05)，與MacLean等[15]的研究結(jié)果相似。本研究結(jié)果還顯示，miRNA-15b相對(duì)表達(dá)水平≤0.78是食管癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素(P<0.05)；低分化早期食管癌患者血清miRNA-15b相對(duì)表達(dá)水平低于高、中分化患者，TNM分期Ⅱ期患者血清miRNA-15b相對(duì)表達(dá)水平低于TNM分期Ⅰ期患者(P<0.05)。這提示miRNA-15b可能與早期食管癌發(fā)生及發(fā)展有關(guān)。Baraniskin等[16]發(fā)現(xiàn)，miRNA-15b鑒別膠質(zhì)瘤和非膠質(zhì)瘤的曲線下面積為0.960，靈敏度和特異度分別為90.00%和94.50%，miRNA-15b可作為診斷膠質(zhì)瘤的生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，miRNA-15b診斷早期食管癌的ROC曲線下面積為0.836(P<0.001)，敏感度為89.50%，特異度僅為72.70%。這提示miRNA-15b也可作為診斷早期食管癌的輔助性指標(biāo)，但診斷效能一般。

有研究表明，miRNA-34c在前列腺癌組織中呈低水平表達(dá)，與前列腺癌患者TNM分期有關(guān)[17]。Achari等[18]的研究表明，乳腺癌組織中miRNA-34c表達(dá)水平下調(diào)，與癌細(xì)胞的增殖抑制和細(xì)胞死亡增加有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，食管癌組患者血清miRNA-34c相對(duì)表達(dá)水平低于對(duì)照組(P<0.05)，miRNA-34c相對(duì)表達(dá)水平0.69是影響早期食管癌發(fā)生危險(xiǎn)因素(P<0.05)；低分化早期食管癌患者血清miRNA-34c相對(duì)表達(dá)水平低于高、中分化患者，TNM分期Ⅱ期患者血清miRNA-34c相對(duì)表達(dá)水平低于TNM分期Ⅰ期患者(P<0.05)。這提示miRNA-34c也與食管癌發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。Gao等[19]的研究表明，miRNA-34c診斷乳腺癌的曲線下面積為0.854，靈敏度為72.00%，特異性為88.80%。本研究結(jié)果顯示，血清miRNA-34c診斷早期食管癌的ROC曲線下面積為0.804(P<0.001)，敏感度為63.20%，特異度為83.60%，與Gao等[20]的研究結(jié)果相似，提示miRNA-34c用于診斷早期食管癌的敏感度較低，效能一般。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，血清miRNA-15b與miRNA-34c聯(lián)合預(yù)測(cè)早期食管癌的ROC曲線下面積為0.949(P<0.001)，敏感度為93.00%，特異度為81.80%，診斷效能明顯提高，這可能是由于兩者通過(guò)不同機(jī)制參與食管癌進(jìn)展，聯(lián)合檢測(cè)可彌補(bǔ)單一檢測(cè)的片面性，但具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，早期食管癌患者血清中miRNA-15b與miRNA-34c表達(dá)水平下調(diào)，且表達(dá)水平可能與食管癌發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。兩者聯(lián)合診斷早期食管癌價(jià)值較高。但由于本研究樣本量較少，研究方法較為單一，兩者在早期食管癌中作用機(jī)制還需進(jìn)一步探究。