王 軒,程為平,程光宇△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

癲癇是由多種原因引起的腦部慢性疾患，產(chǎn)生癲癇發(fā)作的持續(xù)性腦部改變及腦區(qū)高度異常同步化放電是其特征[1]。雖然抗癲癇藥仍是目前治療癲癇的主要手段，但因抗癲癇藥物的毒副作用或外科手術(shù)的禁忌癥等局限，需要尋找其他能輔助或替代治療癲癇的其他手段。電針是在針刺的基礎(chǔ)上加上電療法，具有保持針感、調(diào)整刺激量與強化針刺的作用[2]。本研究通過研究電針百會、腰奇穴對戊四氮致癇大鼠腦電信號的影響，分析波幅、頻率和功率譜密度的改變，探討電針治療戊四氮致癇大鼠的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

30只SD雌性大鼠均來自黑龍江中醫(yī)藥大學動物實驗中心，體質(zhì)量250～280 g，溫度(22±3)℃、12 h明暗循環(huán)的飼養(yǎng)環(huán)境中，給予自由飲食和飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進行耳標標記，用計算機生成的隨機數(shù)表隨機選取10只作為空白組，余20只用于癲癇點燃。所有實驗內(nèi)容經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學動物倫理委員會同意。

1.2 儀器和試劑

戊巴比妥鈉 (1507002-200MG)；16通道生理信號記錄儀(MP150，美國BIOPAC公司);腦立體定位儀(68001，深圳市瑞沃德生命科技有限公司);顱骨鉆(LGZ-1,南京卡爾文生物科技有限公司);電極配件(MS363，E363/20/2.4/SP,美國Plastics One Inc.);30%雙氧水，義齒基托聚合物(Ⅱ型Ⅰ類,上海貝瓊齒材有限公司);義齒基托樹脂(Ⅱ型Ⅰ類,上海新世紀齒科材料有限公司)。

1.3 電極植入

所有大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉腹腔麻醉(50 mg/kg)后剝開頭皮清除骨膜露出頭骨，以前囟為參照點，參考Paxinos & Watson編著的《大鼠腦圖譜》[3]。在左右海馬 (AP：-3.9 mm，ML或MR:2.6 mm) 立體定位鉆孔，植入電極E363后連接MS363基座，用義齒基托材料固定。

1.4 模型建立與癲癇發(fā)作行為學評估

術(shù)后恢復(fù)7 d后連接MP150打開AcqKnowledge軟件記錄基線1 h后進行戊四氮造模。

1.4.1 模型建立 每天上午9：00腹腔注射亞劑量的PTZ35 mg/kg。觀察大鼠的行為學變化并記錄腦電1 h。

1.4.2 癲癇發(fā)作情況 根據(jù)Ravine分級標準[4]：1級，面部抽動，咀嚼明顯；2級，點頭；3級，單側(cè)前肢陣攣抬起；4級，雙側(cè)前肢陣攣抬起和站立；5級，雙側(cè)前肢陣攣，站立以及失去平衡跌倒進行評價。1～3級為局灶性發(fā)作，4～5級為全身性發(fā)作 (大發(fā)作)。當動物連續(xù)至少3次驚厥程度不低于4級且EEG有癲癇樣波出現(xiàn)時視為造模成功，7 d后用于電針治療實驗。在造模過程中，如大鼠持續(xù)性大發(fā)作不止時,當給予10%的水合氯醛(5 mg/kg)搶救?？瞻捉M在相同的時間給予同等劑量的生理鹽水腹腔注射。造模成功的20只大鼠依據(jù)耳標數(shù)字再依據(jù)計算機隨機數(shù)字表法分成模型組、電針組。

1.5 干預(yù)措施

1.5.1 空白組和模型組 每日早09：00用自制保定器固定大鼠，連接腦電記錄數(shù)據(jù)10 min，拆除保定裝置，繼續(xù)記錄腦電圖2 h。

1.5.2 電針干預(yù) ①取穴：依據(jù)《實驗針灸學》[5]中“常用的大鼠針灸穴位及圖譜”進行大鼠穴位的定位及針刺深度。百會穴：大鼠頭頂兩耳根連線與前后中線交點。腰奇穴: 大鼠背部正中腰骶部，第 4腰椎與第1尾椎之間的凹陷中。②針具與儀器：華佗牌毫針，規(guī)格0.18 mm×13 mm；SDZ-Ⅱ型華佗牌電針治療儀。③操作：每日早09：00用自制保定器固定大鼠，暴露四肢。連接腦電記錄數(shù)據(jù)。消毒施術(shù)部位。將毫針于百會穴向后平刺0.9 mm；腰奇穴向前平刺13 mm；將SDZ-Ⅱ型華佗牌電針治療儀的正極、負極導(dǎo)線分別連接百會穴、腰奇穴針柄上。給予的電針刺激參數(shù)[5]為100 Hz，強度以動物能耐受并保持安靜為度，時間為10 min。電針結(jié)束后拆除電針治療儀及保定裝置繼續(xù)記錄腦電圖2 h。1次/d，共計14 d。

1.6 觀測指標

本實驗按照不同階段腦電信號特征對正常組→正常時、模型組→癲癇發(fā)作時和電針組→電針治療時和電針治療后信號截取并施行時域分析，傅里葉變換后進行頻域分析。即提取正常時、癲癇發(fā)作時、電針治療時、電針治療后4個狀態(tài)的腦電波信號強度并對其對比分析。

1.7 信號處理與統(tǒng)計分析

MP150獲取的腦電信號以200 Hz采樣率進行采樣，通帶頻率0.1～100 Hz。濾波50 Hz 。以 10 s 為單位進行信號拼接觀察腦電信號的時域，頻域變化趨勢。計量資料使用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，計數(shù)資料使用百分數(shù)表示，等級資料使用秩均值表示。對滿足正態(tài)性、方差齊性和獨立性的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進行相關(guān)分析，否則采用非參數(shù)檢驗，以P<0.05代表差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01代表差異有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 電針對戊四氮致癇大鼠腦電信號的時域分析結(jié)果

如表1、圖1～2分別顯示4個狀態(tài)下(正常時、發(fā)作時、電針時、電針后)戊四氮致癇大鼠腦電圖和時域指標結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，正常大鼠腦電波平均波幅在7.61 mV，癲癇發(fā)作時平均波幅升高到53.2 mV左右，電針治療時、電針治療后波幅分別為46.48 mV、20.06 mV。與正常時對比，其他狀態(tài)下腦電圖波幅局升高(P<0.01)，與發(fā)作時對比電針時、電針后腦電圖波幅下降(P<0.01)，電針后波幅較電針時波幅下降明顯(P<0.01)。

表1 不同狀態(tài)下腦電信號波幅LSD法事后比較結(jié)果

注：基于估算邊際平均值，*平均值差值的顯著性水平。a多重比較調(diào)節(jié)：最低顯著差異法(相當于不進行調(diào)整)。

圖1 不同狀態(tài)下的腦電圖

圖2 不同狀態(tài)下的波幅(mV)折線輪廓圖

2.2 電針對戊四氮致癇大鼠腦電信號的頻域分析結(jié)果

將圖1中4種狀態(tài)下的腦電信號進行傅里葉變換并進行頻域分析，對表2、圖3的4個狀態(tài)下腦電信號頻率分析發(fā)現(xiàn)；原始腦電信號中，正常大鼠平均頻段范圍(11.47±5.08)，發(fā)作時頻段范圍(22.88±18.5)，數(shù)值升高范圍增加，與正常對比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，電針治療時和治療后頻段范圍(49.61±0.00、41.74±15.65)，與正常時比較數(shù)值升高范圍集中(P<0.01)；與發(fā)作時比較數(shù)值同樣升高范圍集中明顯(P<0.01)。電針治療前后比較，電針后頻段數(shù)值降低范圍略有增寬(P<0.01)。將原始腦電信號進行濾波后發(fā)現(xiàn)Delta、Theta、Alpha、Beta、Gamma共5個頻段的腦電信號主頻率集中趨勢有所變化。Delta波段電針后主頻率波段與正常時和發(fā)作時比較范圍縮小(P<0.01)。Theta波段發(fā)作時與正常時對比，主頻率數(shù)值降低，波動范圍略增大，電針前后與發(fā)作時比較主頻率數(shù)值增大、范圍略縮小，差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。Alpha電針后與正常時、發(fā)作時比較主頻率均略增大(P<0.05或P<0.01)。Beta、Gamma頻段發(fā)作時與正常狀態(tài)對比主頻率數(shù)值降低，范圍變化不明顯(P<0.01)。電針時與正常時和發(fā)作時比較主頻率數(shù)值升高明顯，集中在49.61 Hz(P<0.01)，提示電針時Beta、Gamma高度協(xié)同耦合。電針后Beta頻段主頻率與正常時數(shù)值變化不明顯(P>0.05)，與發(fā)作時對比仍略有增高(P<0.05)，與電針時對比數(shù)值降低明顯(P<0.01)，電針后Gamma頻段與電針時比較差異無統(tǒng)計學意義，主頻率數(shù)值仍集中在49.61 Hz，與正常時、發(fā)作時比較均增高(P<0.01)。

Peak FnRawDeltaThetaAlphaBetaGamma正常1011.47±5.085.14±0.646.69±1.0310.38±2.0618.21±3.3937.00±11.62發(fā)作時1022.88±18.5△△5.11±0.956.59±1.2△△10.29±2.2717.72±4.07△△34.09±11.71△△電針時1049.61±0△△▲▲5.16±0.646.64±0.92▲▲10.4±2.0649.61±0△△▲▲49.61±0△△▲▲電針后41.74±15.65△△▲▲☆5.12±0.55△△▲▲6.66±1.1▲▲10.79±2.29△▲▲18.38±3.49▲☆☆49.61±0△△▲▲

注：不同狀態(tài)間比較采用LSD法;與正常狀態(tài)比較,△P<0.05,△△P<0.01;與發(fā)作時比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01;與電針時比較,☆P<0.05,☆☆P<0.01。

圖3 不同狀態(tài)下的原始腦電信號頻率(Hz)

2.3 電針對戊四氮致癇大鼠腦電信號的功率譜密度(PSD)分析結(jié)果

對如圖4～5所示的4種狀態(tài)下腦電信號進行功率譜密度(PSD)研究發(fā)現(xiàn)，不同狀態(tài)下腦電信號能量值不同、集中頻段不同；正常大鼠能量主要集中在低頻區(qū)域，隨著頻段的增加能量減少，50 Hz左右處存在高度能量值；發(fā)作時各頻段范圍的能量均有增加，頻譜能量主要集中在25 Hz左右，50 Hz處變平坦；電針時Delta、Theta、Alpha、Beta、Gamma頻段均有波動，Gamma頻段的能量高度集中，突出于其他狀態(tài)；電針后各頻段能量均有所降低，波動趨勢接近正常大鼠。圖4中大于50 Hz時原始腦電信號PSD趨勢較平坦。

圖4 不同狀態(tài)下的功率譜密度(mV2/Hz)

圖5 不同狀態(tài)下不同頻段的功率譜密度直方圖

2.4 電針對戊四氮致癇大鼠各頻段腦電信號的功率譜密度(PSD)分析結(jié)果

將圖1中原始腦電信號進行濾波，分析Delta、Theta、Alpha、Beta、Gamma共5個頻段在Total PSD所占的比重與趨勢。如表3、圖6所示不同狀態(tài)下各頻段腦電信號的功率譜密度關(guān)系，正常大鼠腦電信號能量主要集中在Delta頻段，發(fā)作時Delta、Theta、Gamma頻段能量比例降低，Alpha、Beta頻段能量比重升高，其中Beta頻段、Gamma頻段能量比重變化最大。電針時Delta、Theta、Alpha、Beta各頻段能量比重均降低，Gamma頻段能量占68.18%，結(jié)合2.2中電針時Beta、Gamma主頻率高度協(xié)同集中在49.61 Hz猜測，Gamma頻段可能與電針的治療作用相關(guān)。電針后各頻段能量比重接近正常大鼠，Gamma頻段能量比重基本回歸。

表3 不同狀態(tài)下不同頻段的功率譜密度(mV2/Hz)比例

注：從圖1中過濾出頻段Delta：0.3～4 Hz，Theta：4～8 Hz，Alpha:8～13 Hz，Beta:13～30 Hz，Gamma：30～80 Hz，分別計算各頻段能量密度占總能量密度的比例。

圖6 不同狀態(tài)下各頻段腦電信號的功率譜密度箱型圖

3 討論

癲癇病屬于中醫(yī)學的“癇癥”范疇。針灸治療從先秦的《黃帝內(nèi)經(jīng)》到清朝《針灸集成》共有62本著作， 156條文獻， 128個穴位記載[6]。由于癲癇病位在腦，腦為髓海，督脈上行入腦，督脈為陽脈之海，其空虛則不能上榮充腦，造成髓海不足?！岸矫}腰脊強痛，大人癲病，小人風癇疾?！?可見邪犯督脈、經(jīng)氣受阻、清陽不升, 會導(dǎo)致癲癇發(fā)病。督脈作為治療癲疾的首選經(jīng)脈，百會穴是督脈與手足三陽經(jīng)的交會穴，是治療癲癇的重要穴位，具有開竅醒腦、回陽固脫的作用，其可通督定癇、安神定志。腰奇穴是督脈上的經(jīng)外奇穴，亦是治療癲癇的要穴。二者上下相配為用，振奮陽氣、疏調(diào)督脈、上下貫通、腦髓得充、抵御外邪，治療癲癇。在對針刺百會、腰奇穴的抗癲癇機制研究中，柳成剛等[7]發(fā)現(xiàn)二穴相配治療PTZ致癇大鼠可使血清IL-1β表達降低、血清IL-6表達升高、BAX的表達降低、海馬神經(jīng)元的損傷減輕。姜元輝等[8]發(fā)現(xiàn)癲癇大鼠驚厥潛伏期延長、海馬區(qū)NO含量增加、NOS和SOD活力上升。

腦電圖研究方面，昂文平等[9]發(fā)現(xiàn)針刺百會、風池穴時癲癇大鼠的發(fā)作潛伏期延長，癲癇波的持續(xù)時間縮短，癲癇發(fā)作頻率降低。王津存等[10]認為電針刺激百會穴有明顯的抑癇作用，可使致癇大鼠慢性期自發(fā)性癲癇發(fā)作次數(shù)減少，腦電圖癲癇波放電次數(shù)降低，其電生理機制與百會穴的神經(jīng)節(jié)段性分區(qū)有關(guān)，認為百會穴同時位于三叉神經(jīng)和枕大神經(jīng)分布區(qū)域，電刺激后神經(jīng)沖動傳入三叉神經(jīng)感覺核再投射到各個腦區(qū)中樞整合后產(chǎn)生抑癇信號糾正了異常放電。與此理論相似的研究認為刺激穴位產(chǎn)生的興奮信息形成神經(jīng)沖動，由軀干神經(jīng)傳入迷走神經(jīng)分支傳出協(xié)調(diào)自主神經(jīng)張力，調(diào)節(jié)腦區(qū)平衡，達到治療癲癇發(fā)作的效果[11-12]。除此之外，針灸治療癲癇的研究還集中在神經(jīng)遞質(zhì)(NO、5-HT、多巴胺、腎上腺素等)、細胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α等)、第二信使(Ca-CaM)和細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等方面[13-14]，認為針刺可以通過以上途徑調(diào)控相關(guān)基因表達水平達到治療癲癇的目的。

本實驗通過電針百會、腰奇穴對戊四氮致癇大鼠4種狀態(tài)下腦電信號分析后發(fā)現(xiàn)，正常大鼠能量主要集中在Delta頻段(38.54%)、Theta頻段(23.24%)，Gamma頻段比例最低(4.47%)。癲癇發(fā)作時常見的癲癇波為棘波、尖波、棘慢波、尖慢波等[15]，棘波的頻段范圍14～50 Hz，尖波的頻段范圍5～14 Hz，棘慢復(fù)合波、尖慢復(fù)合波的頻段范圍在2～5 Hz。本研究中癲癇發(fā)作時波幅從7.61 mV升高到53.2 mV，頻率變化集中在Beta頻段和Gamma頻段，前者主頻率數(shù)值降低集中在(17.72±4.07)Hz，后者主頻率升高集中在(34.09±11.71)Hz， Alpha頻段、Beta頻段的功率譜密度能量比重顯著增加，Gamma頻段比重降低明顯。提示戊四氮致癇大鼠癲癇發(fā)作時癲癇波主要表現(xiàn)為棘波，PTZ致癇大鼠癲癇發(fā)作時波幅升高，各頻段主頻率數(shù)值或增高或降低，能量比重失調(diào)，去趨勢明顯。電針治療時、治療后腦電信號波幅降低向正常狀態(tài)回歸，電針時頻段改變主要集中在Beta頻段和Gamma頻段，二者高度擬合，主頻率均集中在49.61 Hz。電針后Beta頻段主頻率基本回歸到正常水平，Gamma頻段主頻率仍集中在49.61 Hz。結(jié)果表明，電針百會、腰奇穴對戊四氮致癇大鼠的腦電信號影響主要集中在Beta頻段、Gamma頻段。現(xiàn)代研究認為新皮質(zhì)的電活動可通過內(nèi)嗅皮質(zhì)傳入海馬，在此經(jīng)過整合后，輸出到邊緣系統(tǒng)其他結(jié)構(gòu)、大腦皮質(zhì)及腦干下行通路[15]。海馬的特殊環(huán)路結(jié)構(gòu)使之具有“放大器”的效應(yīng)，微小異常的電活動在此環(huán)路內(nèi)被逐漸放大，經(jīng)傳出通路抵達效應(yīng)器后引起腦電活動的異常同步化，因而海馬常常為癲癇發(fā)作的起源地。神經(jīng)元具有頻率共振特性，海馬椎體細胞的胞體、丘腦皮質(zhì)神經(jīng)元等在θ頻段有很好的共振特性，抑制性中間神經(jīng)元在Gamma頻段有更好的共振性[15]。海馬抑制性中間神經(jīng)以GABA能神經(jīng)元為主，因此推測GABA能神經(jīng)元與Gamma頻段相關(guān)。GABA能神經(jīng)元是海馬中主要的抑制性中間神經(jīng)元，GABA能神經(jīng)元在海馬神經(jīng)環(huán)路中起著節(jié)律發(fā)生器的作用，其分泌的γ-氨基丁酸是拮抗谷氨酸興奮性的主要神經(jīng)遞質(zhì)，GABA能神經(jīng)元興奮γ-氨基丁酸分泌增多，GABA/GLU比值增加拮抗癲癇發(fā)作。有研究指出抗癲癇藥物和鎮(zhèn)靜催眠類藥物(巴比妥類、苯二氮卓類)可以引起B(yǎng)eta頻段的主頻率增加，這可能與藥物和GABAA受體結(jié)合促進活性、增強中樞抑制有關(guān)。

綜上，通過對電針百會、腰奇穴對戊四氮致癇大鼠腦電信號的影響分析后得出，電針百會、腰奇穴可以降低戊四氮致癇大鼠腦電信號波幅，提高Beta頻段和Gamma頻段的主頻率，協(xié)調(diào)各頻段的能量，使各指標回歸到正常狀態(tài)；其抗癲癇作用與GABA 中間抑制性神經(jīng)元產(chǎn)生的興奮性電活動相關(guān)。