歐陽(yáng)金明 楊明華

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053

2 浙江省中藥研究所 浙江 杭州 310016

筆者通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究，分析丹栝方對(duì)糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化大鼠糖脂代謝及活性氧（ROS）、胸主動(dòng)脈核因子κB（NF-κB）及其mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選擇我院實(shí)驗(yàn)中心提供的80只雄性SPF級(jí)糖尿病GOTO-KAKIZAKI大鼠作為研究對(duì)象，糖尿病均為自發(fā)，均為13周齡，平均體質(zhì)量346.98±25.13g；同時(shí)選擇我院實(shí)驗(yàn)中心提供的20只雄性SPF級(jí)Wistar大鼠開(kāi)展研究，均為13周齡，平均體質(zhì)量362.85±12.37g。根據(jù)每籠5只將大鼠獨(dú)立飼養(yǎng)在通氣籠具系統(tǒng)中，設(shè)定溫度21～23℃，濕度45.0%～55.0%，飼料配方：由實(shí)驗(yàn)中心提供普通飼料，高脂飼料由2.00%膽固醇、87.63%普通飼料、0.07%丙基硫氧嘧啶、10.00%精煉豬油和0.30%豬膽鹽構(gòu)成。

1.2 方法：分述如下。

1.2.1 藥物：丹栝方屬中藥方劑，配伍嚴(yán)謹(jǐn)，方劑組成如下：丹參、白僵蠶9g，瓜蔞（栝蔞）12g，川芎、郁金、薤白各10g，赤芍6g。加水煎煮成1g/ml丹栝方藥液（內(nèi)含原生藥1∶1）。辛伐他?。ê贾菽硸|制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20180007，20mg/片）配制為懸濁液，濃度0.25mg/ml。二甲雙胍（山東力諾制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H37023557，0.25g）準(zhǔn)確配制為懸濁液，濃度18.75mg/ml。

1.2.2 造模：取80只GOTO-KAKIZAKI大鼠,2次快速血糖平均水平≥11.1mmol/L視作糖尿病成模大鼠。所有GOTO-KAKIZAKI大鼠給予高脂飼料喂飼，腹腔注射10mg/（kg?d）NOS抑制劑-L-NAME（N-硝基L-精氨酸甲酯），持續(xù)喂飼2周，介導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生。6個(gè)月后，于顯微鏡下觀察動(dòng)脈形態(tài)。給予每只大鼠皮下注射2U/d諾和靈N，持續(xù)注射10d，結(jié)果顯示大鼠的易激惹癥狀不斷減輕。于第14d檢測(cè)血糖水平約為10mmol/L，停止胰

1.2.3 分組和干預(yù)方法：根據(jù)體質(zhì)量對(duì)GOTO-KAK‐IZAKI糖尿病成模大鼠進(jìn)行分層，依據(jù)血糖水平，按隨機(jī)數(shù)表法分成丹栝方組20只，應(yīng)用8ml/（kg·d）丹栝方治療；二甲雙胍組20只，應(yīng)用150mg/（kg·d）二甲雙胍治療；辛伐他汀組20只，應(yīng)用2mg/（kg·d）辛伐他汀治療；模型組20只，給予8ml/（kg·d）無(wú)菌水喂飼；同期選擇20只同齡、同體質(zhì)量Wistar大鼠納入正常對(duì)照組，給予普通飼料喂飼。在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上干預(yù)管理6個(gè)月后，各組大鼠不禁水但禁食12h獲取組織標(biāo)本。

1.2.4 測(cè)定指標(biāo)：對(duì)大鼠的毛發(fā)和精神狀態(tài)、食量、活動(dòng)狀況、體質(zhì)量等進(jìn)行觀察。6個(gè)月后，各組大鼠均接受12h禁食，經(jīng)腹腔注射0.3ml/100g的10%水合氯醛。麻醉后于腹部正中線位置剖開(kāi)，分離腹主動(dòng)脈血管，抽取血液10ml后置于3000r/min離心處理10min，提取血清，放于-20℃冰箱內(nèi)凍存，待測(cè)。另抽取1ml血液，置于10%EDTA二鈉中混勻，經(jīng) 3000r/min離心處理后提取血清，放于-20℃冰箱內(nèi)凍存，備用。采集大鼠胸椎動(dòng)脈弓組織置于4%多聚甲醛固定，實(shí)施HE染色；后將部分胸主動(dòng)脈置入RNA液內(nèi)進(jìn)行保存，備用，檢測(cè)其mRNA。

1.2.5 檢測(cè)基礎(chǔ)指標(biāo)：經(jīng)全自動(dòng)生化儀對(duì)大鼠的空腹血糖（FBG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、甘油三酯（TG）等指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并經(jīng)特定蛋白分析儀檢測(cè)糖基化血紅蛋白（HbA1c）表達(dá)水平；同時(shí)，經(jīng)雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定ROS表達(dá)，嚴(yán)格按試劑盒要求開(kāi)展實(shí)驗(yàn)操作，試劑盒每列設(shè)定8孔，并每組設(shè)8個(gè)標(biāo)本。

1.2.6 免疫組化法檢測(cè)胸主動(dòng)脈NF-κB陽(yáng)性表達(dá)率：經(jīng)免疫組化法測(cè)定胸主動(dòng)脈NF-κB表達(dá)，嚴(yán)格按試劑盒要求實(shí)施操作，于顯微鏡下對(duì)細(xì)胞內(nèi)陽(yáng)性表達(dá)進(jìn)行觀察，若分布棕黃色顆粒代表陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)。

1.2.7 RT-PCR測(cè)定主動(dòng)脈NF-κB mRNA陽(yáng)性表達(dá)：經(jīng)RT-PCR法測(cè)定主動(dòng)脈NF-κB mRNA表達(dá)，包括提取總RNA、逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA、設(shè)計(jì)/合成引物、RT-PCR擴(kuò)增cDNA，所有操作均嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)要求實(shí)施。經(jīng)Rotor-Gene 6.0軟件依據(jù)反應(yīng)的熒光對(duì)數(shù)據(jù)、標(biāo)準(zhǔn)品濃度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，對(duì)CT值進(jìn)行計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS 23.0研究統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料用±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用n（%）表示，組間比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基礎(chǔ)情況：各組大鼠接受干預(yù)前狀態(tài)表現(xiàn)良好，活潑好動(dòng)且被毛光澤，但產(chǎn)生易激惹征象。實(shí)驗(yàn)期間，辛伐他汀組、二甲雙胍組和模型組的大鼠分別死亡2只、4只、4只；丹栝方組和正常對(duì)照組大鼠未死亡。干預(yù)前各組大鼠的體質(zhì)量對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；但干預(yù)完成時(shí)模型組、丹栝方組、二甲雙胍組、辛伐他汀組GOTO-KAKIZAKI大鼠的體質(zhì)量均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；相較于干預(yù)前，干預(yù)后模型組和丹栝方組大鼠的體質(zhì)量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；正常Wistar大鼠的體質(zhì)量隨著觀察時(shí)間延長(zhǎng)而顯著增高。見(jiàn)表1。

2.2 各組FBG和HbA1c：干預(yù)后模型組大鼠的FBG、HbA1c水平均高于正常對(duì)照組、丹栝方組、辛伐他汀組、二甲雙胍組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表1 干預(yù)前后各組大鼠的體質(zhì)量對(duì)比（±s，g）

表1 干預(yù)前后各組大鼠的體質(zhì)量對(duì)比（±s，g）

注：與正常對(duì)照組比較，aP＜0.05；與干預(yù)前比較，bP＜0.05。

干預(yù)后518.65±19.41b 374.53±23.55ab 368.24±30.97ab 357.62±30.89a 347.76±25.13a組別正常對(duì)照組模型組丹栝方組辛伐他汀組二甲雙胍組例數(shù)20 16 20 18 16干預(yù)前362.27±11.64 359.82±29.76 357.29±23.43 358.36±24.32 356.84±25.19

表2 干預(yù)后各組大鼠的FBG和HbA1c水平比較（±s）

表2 干預(yù)后各組大鼠的FBG和HbA1c水平比較（±s）

注：與模型組比較，#P＜0.05。

組別正常對(duì)照組模型組丹栝方組辛伐他汀組二甲雙胍組HbA1c（%）5.52±0.26#9.23±1.07 7.38±0.91#8.40±0.79#7.74±1.03#例數(shù)20 16 20 18 16 FBG（mmol/L）3.04±0.47#10.78±0.73 6.25±1.11#7.49±1.85#6.37±0.69#

2.3 各組血脂指標(biāo)和ROS水平：模型組大鼠LDL-C及TC、HDL-C水平均高于正常對(duì)照組；模型組大鼠LDL-C和TC、TG、ROS水平均高于丹栝方組、辛伐他汀組、二甲雙胍組；丹栝方組大鼠LDL-C和TC、TG水平均低于二甲雙胍組；丹栝方組大鼠HDL-C水平高于辛伐他汀組，上述差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠干預(yù)24周后血脂指標(biāo)、ROS表達(dá)水平對(duì)比（±s，mmol/L）

表3 各組大鼠干預(yù)24周后血脂指標(biāo)、ROS表達(dá)水平對(duì)比（±s，mmol/L）

注：與模型組比較，#P＜0.05；與丹栝方組比較，eP＜0.05；與辛伐他汀組比較，fP＜0.05。

ROS 22.29±2.34 22.18±1.97 18.86±3.20#17.54±3.31#16.98±1.95#組別正常對(duì)照組模型組丹栝方組辛伐他汀組二甲雙胍組例數(shù)20 16 20 18 16 LDL-C 0.58±0.33#13.84±1.17 7.26±1.12#8.15±2.01#9.13±0.94#e TC 2.39±0.24#16.38±1.15 9.87±0.83#10.54±2.03#11.68±0.95#e HDL-C 0.75±0.16#2.11±0.18 2.41±0.13f 1.75±0.24 2.06±0.25 TG 1.99±0.52 1.73±0.16 0.79±0.22#1.27±0.25#1.02±0.37#e

表4 各組大鼠的NF-κB、NF-kB mRNA陽(yáng)性表達(dá)率（±s，%）

表4 各組大鼠的NF-κB、NF-kB mRNA陽(yáng)性表達(dá)率（±s，%）

注：與模型組比較，#P＜0.05；與二甲雙胍組比較，*P＜0.05。

NF-κB mRNA 20.17±3.28#43.94±0.52 32.18±0.23#*16.34±0.05#*36.85±0.31#組別正常對(duì)照組模型組丹栝方組辛伐他汀組二甲雙胍組例數(shù)20 16 20 18 16 NF-κB陽(yáng)性表達(dá)1.49±0.31#10.82±0.83 6.20±0.86#6.73±0.79#6.92±0.73#

2.4 各組NF-κB、NF-κB mRNA陽(yáng)性表達(dá)率：模型組大鼠NF-κB陽(yáng)性表達(dá)率、NF-κB mRNA陽(yáng)性表達(dá)率均高于正常對(duì)照組、丹栝方組、辛伐他汀組、二甲雙胍組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；丹栝方組、辛伐他汀組大鼠的NF-κB mRNA陽(yáng)性表達(dá)率均低于二甲雙胍組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

2.5 各組免疫組化法結(jié)果：于顯微鏡下觀察NF-κB陽(yáng)性表達(dá)多處于中膜平滑細(xì)胞、內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞核內(nèi)，能發(fā)現(xiàn)褐色染色顆粒。正常組大鼠血管內(nèi)膜偶見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)；模型組呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，能見(jiàn)密集分布的褐色染色顆粒；而辛伐他汀組為陽(yáng)性表達(dá)，內(nèi)膜能發(fā)現(xiàn)分布較多褐色染色顆粒；但較弱于模型組；同時(shí)，丹栝方組、二甲雙胍組為弱陽(yáng)性表達(dá)，能見(jiàn)散在分布的褐色染色顆粒。微量核酸-蛋白定量?jī)x定量提取各組大鼠胸主動(dòng)脈的總RNA發(fā)現(xiàn)，OC260/OC280值全部處于1.8～2.0范圍。

3 討論

近年來(lái)，隨著臨床深入研究氧化應(yīng)激發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)患者血糖和血脂水平恢復(fù)正常，或是將氧化應(yīng)激產(chǎn)生阻斷，將氧化應(yīng)激產(chǎn)物消除，能有效降低氧化應(yīng)激；但因氧化應(yīng)激、肥胖、增齡、不良環(huán)境、吸煙和缺乏運(yùn)動(dòng)等相關(guān)因素影響，難以徹底消除氧化應(yīng)激[1]。ACCORC（劃時(shí)代控制糖尿病心血管風(fēng)險(xiǎn)行動(dòng)）研究結(jié)果顯示，開(kāi)展嚴(yán)格的及強(qiáng)化的降壓和降糖、降脂干預(yù)，能有效減輕糖尿病大血管病變，預(yù)防或緩解糖尿病微血管病變[2]。研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥的多靶點(diǎn)作用存在多效性特點(diǎn)，如丹栝方具有適度的氧化應(yīng)激調(diào)控能力，能夠在降低患者糖代謝指標(biāo)、改善患者血液黏度的基礎(chǔ)上，在預(yù)防心血管并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)中亦能起到良好的作用[3]。研究結(jié)果表明，體內(nèi)氧化應(yīng)激因子是造成糖尿病患者并發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化綜合征的主要指標(biāo)機(jī)制和影響因素；而血液中的高脂、高糖通過(guò)刺激代謝系統(tǒng)，分泌氧化應(yīng)激因子，進(jìn)而對(duì)糖尿病患者的血管內(nèi)皮細(xì)胞造成永久性損傷[4]。相關(guān)研究指出，氧化應(yīng)激為心血管疾病、胰島素抵抗及糖尿病等相關(guān)病變發(fā)生的基礎(chǔ)，故認(rèn)為對(duì)氧化應(yīng)激進(jìn)行干預(yù)，能有效防治糖尿病和其血管并發(fā)癥[5]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，糖尿病是一種氣血津液疾病，機(jī)體痰濁易生和代謝失調(diào)為糖尿病發(fā)生重要原因，長(zhǎng)時(shí)間可導(dǎo)致痰瘀互結(jié)及脈絡(luò)失養(yǎng)。丹栝方作為中藥制劑，將方內(nèi)丹參和栝蔞作為君藥，具有化痰活血的作用；其中丹參性寒能入營(yíng)血，而栝蔞性寒、潤(rùn)，兩者合用發(fā)揮活血化瘀、清熱祛邪、養(yǎng)護(hù)營(yíng)陰等功效，達(dá)到標(biāo)本兼治作用；方內(nèi)川芎、赤芍、白僵蠶及郁金作為臣藥，能增強(qiáng)活血化瘀及祛邪作用；薤白等佐藥理氣散結(jié)、寬胸通陽(yáng)。諸藥合用，能強(qiáng)化痰瘀同治及清潤(rùn)通絡(luò)功效。相關(guān)研究顯示，赤芍多糖和川芎多糖均能清除自由基和超氧陰離子；丹參能抵抗大鼠動(dòng)脈粥樣硬化，增加超氧化物歧化酶表達(dá)，減少丙二醛表達(dá)[6-7]。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者體內(nèi)高指標(biāo)葡萄糖會(huì)通過(guò)人體代謝系統(tǒng)分解生成丙酮酸，而丙酮酸一旦通過(guò)三羧酸循環(huán)為線粒體呼吸鏈提供過(guò)多供氫體，會(huì)大幅增加體內(nèi)生成活性氧[8]?；钚匝踝鳛槿梭w主要細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，抑制三磷酸甘油醛脫氫酶活性，誘發(fā)心血管并發(fā)癥。藥理學(xué)研究顯示，丹栝方能使高糖培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中ROS表達(dá)顯著降低[9]。本研究結(jié)果顯示，丹栝方能明顯減少高糖高脂動(dòng)脈硬化模型大鼠循環(huán)血液內(nèi)活性氧表達(dá)水平。丹栝方能發(fā)揮調(diào)脂和調(diào)糖作用，對(duì)高糖和高脂釋放的ROS進(jìn)行抑制，并能對(duì)NF-κB的陽(yáng)性表達(dá)、NF-κB mRNA表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，阻斷氧化應(yīng)激引起的炎癥反應(yīng)[10]。本研究表明，模型組大鼠NF-kB陽(yáng)性表達(dá)率、NF-κB mRNA陽(yáng)性表達(dá)率均高于正常對(duì)照組、丹栝方組、辛伐他汀組、二甲雙胍組；丹栝方組、辛伐他汀組大鼠的NF-κB mRNA陽(yáng)性表達(dá)率均低于二甲雙胍組；提示丹栝方能有效調(diào)節(jié)糖脂代謝，減輕氧化應(yīng)激，預(yù)防糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化。

綜上所述，丹栝方可調(diào)節(jié)糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化大鼠的血糖和血脂，減輕氧化應(yīng)激，改善糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化情況。但因糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化的連接環(huán)節(jié)較為復(fù)雜，涉及抗炎、內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)、細(xì)胞趨化、抗增殖和細(xì)胞黏附等情況，后期需開(kāi)展深入研究。