黃學(xué)仄 姜春燕 黃志盛 鄭小偉#

1 蒼南縣中醫(yī)院 浙江 蒼南 325800

2 浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 浙江 杭州 310053

3 慈溪市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)療健康集團(tuán)慈溪市紅十字醫(yī)院 浙江 慈溪 315300

慢性哮喘是一種非傳染性的炎癥性氣道疾病，其特點(diǎn)是可逆的高反應(yīng)性和進(jìn)行性氣道炎癥。腎氣虛型哮喘是支氣管哮喘常見的分型之一，中藥益腎喘寧湯在腎氣虛哮喘治療中具有療效確切、副作用小、安全可靠等優(yōu)勢(shì)。Jak-STAT信號(hào)途徑可參與細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等過程[1-2]，與哮喘發(fā)病機(jī)制之間存在著特別密切而復(fù)雜的關(guān)系。本研究采用Jak-STAT信號(hào)通路磷酸化抗體芯片技術(shù)全方位檢測(cè)腎氣虛哮喘大鼠以及益腎喘寧湯干預(yù)后Jak-STAT信號(hào)通路的蛋白磷酸化水平變化，篩選出磷酸化調(diào)變位點(diǎn)，為后續(xù)的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性Wistar大鼠30只，鼠齡6～8w，重量220～250g。自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司購買，依照《中華人民共和國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》相關(guān)條例飼養(yǎng)在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 主要試劑與藥物：OVA卵清蛋白（OVA，gradeV，sigma有限公司，批號(hào)：SLBQ9036V）；Al(OH)3粉末（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20130818）；益腎喘寧湯由熟地黃、淮山藥、山茱萸、澤瀉、丹皮、茯苓、苦參、天漿殼各12g，旋覆花、黛蛤散、生黃芪各15g，北五味子5g，沉香8g組成，中藥飲片均從浙江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)門診部購買，用自動(dòng)煎藥機(jī)制備成含生藥量1.6g/ml的藥液，存放于4℃冰箱，備用。

1.3 主要儀器和軟件：芯片掃描儀（Axon Instruments，USA）；酶標(biāo)儀（PE Victor，PE，USA）；芯片小型離心機(jī)（ChipMate PMC-082，Tomy，Japan）；Jak-STAT信號(hào)通路磷酸化抗體芯片（Full moon，美國）；軟件GenePix Pro 6.0（Axon Instruments，USA）。

1.4 方法：適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、腎氣虛哮喘模型組、中藥組，10只/組。根據(jù)課題組前期實(shí)驗(yàn)造模方法[3]，除正常對(duì)照，其余大鼠均采用OVA致敏法進(jìn)行哮喘造模，在“恐傷腎”“恐則氣下”“勞則氣耗”等中醫(yī)學(xué)理論指導(dǎo)下采取游泳力竭法、梅花針刺激、懸吊應(yīng)激等方法進(jìn)行腎氣虛證型造模，共持續(xù)2周。實(shí)驗(yàn)第15天開始，中藥組大鼠均予益腎喘寧湯灌胃，日給藥劑量參照《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》計(jì)算大鼠的等效劑量。實(shí)驗(yàn)第29天，用戊巴比妥鈉麻醉大鼠后進(jìn)行腹腔取血，解剖后分離肺臟并取出，切取部分肺組織存放于10%中性福爾馬林溶液中，用于病理檢測(cè)；另一部分用生理鹽水沖洗干凈，切取直徑4～5mm大小的肺組織置于凍存管內(nèi)，隨后投入液氮中，最后將所收集樣本轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱。

1.5 模型驗(yàn)證：觀察并記錄各組大鼠造模、給藥前后一般情況的改變，包括飲食量、活動(dòng)量、呼吸情況、毛發(fā)順澤度等；肺組織的常規(guī)HE染色、病理切片用于顯微鏡下觀察分析。

1.6 信號(hào)通路磷酸化抗體芯片技術(shù)：Jak-STAT信號(hào)通路磷酸化抗體芯片分析：①Jak-STAT信號(hào)通路磷酸化抗體芯片檢測(cè)：按照Full Moon公司標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行樣品蛋白抽提、標(biāo)記，芯片封閉和芯片雜交后，GenePix 4000B掃描芯片。②數(shù)據(jù)分析：對(duì)掃描獲取的芯片圖像，GenePixTMPro v6.0軟件讀取原始數(shù)據(jù)，對(duì)芯片背景、陽參及內(nèi)參位點(diǎn)的信號(hào)強(qiáng)度情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算每個(gè)蛋白位點(diǎn)的熒光信號(hào)的均值、標(biāo)準(zhǔn)差、標(biāo)準(zhǔn)誤。組內(nèi)每種抗體的磷酸化水平=該種抗體磷酸化位點(diǎn)的信號(hào)值均值/對(duì)應(yīng)非磷酸化位點(diǎn)的信號(hào)值均值。將組間調(diào)變差異磷酸化位點(diǎn)蛋白數(shù)控制在總檢測(cè)蛋白數(shù)的10%～30%的條件下設(shè)置實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組的組間比值FC≥1.3或≤1/1.3獲得的磷酸化位點(diǎn)蛋白。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況觀察：整個(gè)造模期間，正常組大鼠無特殊變化，毛發(fā)順澤，呼吸平穩(wěn)，行動(dòng)如常，納食二便無異常變化；造模后腎氣虛哮喘模型組大鼠呼吸頻率加快、口唇發(fā)紫，在每日霧化激發(fā)后尤為顯著，體質(zhì)量增長幅度不如正常組大鼠，毛發(fā)比正常組粗糙色黯，伴時(shí)常躁動(dòng)不安、蜷臥扎堆、抓耳撓腮、大小便失禁等癥狀；中藥組上述情況較腎氣虛哮喘組均有明顯改善。

2.2 肺組織HE染色結(jié)果：正常組樣本的肺泡、支氣管結(jié)構(gòu)均清晰完好；腎氣虛哮喘模型組大鼠肺組織切片可觀察到炎性細(xì)胞（包括嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞）浸潤、支氣管上皮脫落和平滑肌增厚的病理變化；中藥組大鼠的肺組織切片可觀察到上述現(xiàn)象均有所改善。

2.3 芯片檢測(cè)結(jié)果：從每組大鼠中，隨機(jī)抽取一個(gè)肺組織樣本，采用信號(hào)通路磷酸化抗體芯片技術(shù)檢測(cè)大鼠肺組織Jak-STAT通路相關(guān)蛋白磷酸化水平變化。結(jié)果詳見表1。

表1 Jak-STAT信號(hào)通路磷酸化抗體芯片調(diào)變位點(diǎn)

3 討論

課題組前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)腎氣虛哮喘模型中存在T細(xì)胞分化過程，以及相關(guān)炎癥因子分泌異常，益腎喘寧湯正是通過影響該過程以及促進(jìn)抑炎因子分泌起效，這與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療哮喘的原理基本一致，但其治療哮喘的具體作用機(jī)制尚未明確。本研究所采用的益腎喘寧湯為筆者臨床驗(yàn)方，本方以七味都?xì)馔铻榛A(chǔ)，加入生黃芪增強(qiáng)益氣，苦參、天漿殼、旋覆花、黛蛤散、沉香調(diào)節(jié)升降失常之氣機(jī)。諸藥合用，共同發(fā)揮平喘益腎、清肺止咳的功效。

本實(shí)驗(yàn)采用Jak-STAT信號(hào)通路磷酸化抗體芯片檢測(cè)和分析，發(fā)現(xiàn)腎氣虛哮喘大鼠相比于正常組大鼠，存在8個(gè)調(diào)變磷酸化位點(diǎn)。其中，與正常組相比，腎氣虛哮喘模型組大鼠有3個(gè)位點(diǎn)上調(diào)（STAT5B、JAK1、JAK2蛋白），5個(gè)位點(diǎn)下調(diào)（STAT5A、STAT1、STAT3、PTPN11、IL10RA蛋白），經(jīng)過益腎喘寧湯干預(yù)后的大鼠有2個(gè)位點(diǎn)（STAT5A、PTPN11蛋白）上調(diào)。

STAT5A和STAT5B是高度同源的蛋白質(zhì)，在免疫功能中發(fā)揮獨(dú)特作用[4]。Burnham等[5]發(fā)現(xiàn)變應(yīng)性哮喘時(shí)嗜酸性粒細(xì)胞STAT5下調(diào)的證據(jù)。腎氣虛哮喘模型組STAT5A下調(diào)，經(jīng)中藥干預(yù)后上調(diào)，提示益腎喘寧湯可能通過上調(diào)STAT5A來調(diào)控Th2和Th17的分化發(fā)揮作用。蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2(PTPN11)是一種廣泛表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)酶，具有通過作用于AKT下游并抑制mTOR活性形式來控制細(xì)胞因子/生長因子途徑的能力。本實(shí)驗(yàn)中腎氣虛哮喘大鼠PTPN11下調(diào)，益腎喘寧湯干預(yù)后PTPN11上調(diào)，提示益腎喘寧湯可能通過調(diào)節(jié)SHP2蛋白改善大鼠炎癥反應(yīng)。

綜上，益腎喘寧湯有效抑制腎氣虛哮喘大鼠炎癥反應(yīng)，可能是通過Jak-STAT信號(hào)通路來調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群比例，改善機(jī)體免疫功能的。