張虹艷,邱國玉,吳福祥,許曉輝,李晨曦,潘秀麗,王小喬

(蘭州市食品藥品檢驗(yàn)所,甘肅蘭州 730050)

隨著人民生活水平的改善,藥物殘留日益受到關(guān)注[1]?；前奉愃幬?sulfonamides,SAs)是一類含有對(duì)氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的廣譜抗菌藥物,廣泛的應(yīng)用于畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖。由于養(yǎng)殖戶在預(yù)防和治療動(dòng)物疾病過程中的不規(guī)范使用,導(dǎo)致動(dòng)物源食品中出現(xiàn)抗菌類藥物殘留[2]?；前奉愃幬餁埩敉ㄟ^食物鏈進(jìn)入人體會(huì)引起過敏反應(yīng)、腸道菌群失調(diào)等副作用[3]。我國以及歐盟對(duì)動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物殘留限量有嚴(yán)格規(guī)定,我國農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告要求,動(dòng)物源性食品以及組織中磺胺類總量最大殘留限量為100 μg/kg。

目前,磺胺類藥物殘留的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[4-5]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[6-7]、毛細(xì)管電泳[8],免疫分析法[9]。高效液相色譜法通用性強(qiáng);免疫分析法專屬性高、操作簡(jiǎn)易;毛細(xì)管電泳分離效能高、試劑、耗材消耗少,但是上述三種方法均存在靈敏度低的問題,不適用于痕量物質(zhì)的檢測(cè)。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法通過保留時(shí)間、特征離子對(duì)以及離子對(duì)豐度比進(jìn)行定性定量分析,方法專屬性強(qiáng),靈敏度高,越來越成熟的應(yīng)用于藥物殘留檢測(cè)。藥物殘留檢測(cè)中應(yīng)用較多的前處理技術(shù)有固相萃取(SPE)[10-11]、加速溶劑萃取(ASE)[12]、基質(zhì)分散固相萃取(MSPD)[13-14]、QuEChERS[15-16]、微波輔助萃取(MAE)[17]、磁性固相萃取[18-19]。

上述前處理方法過程復(fù)雜,大多數(shù)需要經(jīng)過提取、凈化、濃縮等步驟,既消耗了大量的時(shí)間和耗材,同時(shí)降低了方法的檢測(cè)靈敏度,磁性固相萃取技術(shù)多以石墨烯為材料,成本較高。QuEChERS法具有高通量、低成本、節(jié)省試劑和耗材的優(yōu)勢(shì),被廣泛應(yīng)用于果蔬、植物、谷物、肉類的檢測(cè),并納入GB 23200.113-2018(植物源性食品中208種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測(cè)定)。由于動(dòng)物源性食品基質(zhì)復(fù)雜,前期的研究大多未考慮不同樣品基質(zhì)對(duì)定量結(jié)果的影響?；|(zhì)效應(yīng)主要指試樣中的非待測(cè)組分影響待測(cè)物濃度或質(zhì)量測(cè)定的準(zhǔn)確度,引起待測(cè)物響應(yīng)值增加或減少的現(xiàn)象[20]。不同的前處理方法、不同的樣品來源、不同的色譜分析條件、不同的離子源都會(huì)產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)。樣品中的共流物與目標(biāo)成分產(chǎn)生離子競(jìng)爭(zhēng),從而導(dǎo)致目標(biāo)物的離子化效率升高或者降低,引起基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)或者基質(zhì)效應(yīng)抑制[21],是導(dǎo)致液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法定量分析結(jié)果不準(zhǔn)確的直接原因。

針對(duì)上述情況,本實(shí)驗(yàn)以豬肉、牛奶、雞蛋為研究對(duì)象,采用組織研磨儀-QuEChERS-三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀,對(duì)動(dòng)物源性食品中磺胺類獸藥殘留進(jìn)行研究。組織研磨儀采用上下垂直高速振蕩模式,可以促進(jìn)細(xì)胞快速破碎、細(xì)胞裂解、組織勻漿,使得樣品研磨更加均勻、充分,樣品重復(fù)性好,樣品之間沒有交叉污染,同時(shí)節(jié)省了時(shí)間和人力成本的消耗,是一種高通量高速率高效的樣品前處理技術(shù)。研究不同條件下,組織研磨儀對(duì)磺胺類藥物提取效果的影響,并探索豬肉、雞蛋、牛奶三種動(dòng)物源性食品的基質(zhì)效應(yīng),為優(yōu)化獸藥殘留檢測(cè)方法、提高獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬肉(后腿)、牛奶(未脫脂)、雞蛋 均為蘭州市超市采購;磺胺間二甲氧嘧(SDM,純度≥99.4%)、磺胺鄰二甲氧嘧啶(SDX,純度≥99.1%)、磺胺喹沙啉(SQX,純度≥98.9%)、甲氧芐啶(TMP,純度≥99.8%)、磺胺氯噠嗪(SCP,純度≥99.1%)、磺胺間甲氧嘧啶(SMM,97.0%)、磺胺二甲嘧啶(SM2,純度≥100.0%)、磺胺甲基嘧啶(SMR,純度≥99.7%)、磺胺甲惡唑(SMZ,純度≥99.5%)、磺胺嘧啶(SDZ,純度≥99.7%) 德國Dr.Ehrenstorfer公司;乙腈 色譜純,默克公司;QuEChERS萃取鹽包(5982-0032)、EMR-Lipids凈化管(5982-1010) 安捷倫;EDTA緩沖液(檸檬酸8.4 g,磷酸氫二鈉7.1 g,乙二胺四乙酸二鈉19.5 g,溶于650 mL水中)。

1290-6460三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀 美國安捷倫;GENO2010組織研磨儀 美國SPEX;5810R冷凍離心機(jī) 德國艾本德;VORTEX KB-3渦旋振蕩器 中國海門其林貝爾;MS105DU電子天平 美國梅特勒。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液:準(zhǔn)確稱取10 種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品各10.00 mg,分別用乙腈溶解并定容于10 mL容量瓶中,得到1 mg/mL磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品的儲(chǔ)備液,于4 ℃冰箱中保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:分別精密移取各標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液0.1 mL至100 mL容量瓶中,用乙腈稀釋并定容,配成濃度各為1.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,于4 ℃冰箱中保存。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液:稱取與試樣基質(zhì)相應(yīng)的陰性樣品,加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量,與樣品同時(shí)進(jìn)行提取和凈化。

1.2.2 樣品前處理 將豬肉和雞蛋進(jìn)行勻漿處理,牛奶直接取樣。準(zhǔn)確稱取2.0 g(精確至0.01 g)以上樣品置于50 mL離心管中,加入3 mL EDTA緩沖液,組織研磨儀以1000 r/min的轉(zhuǎn)速提取2 min,準(zhǔn)確加入5 mL乙腈,渦旋1 min,加入Bond QuEChERS萃取鹽包,渦旋1 min,靜置10 min,在4 ℃以8000 r/min低溫離心5 min,水和乙腈分層,收集上層液作為提取液。凈化管中,加入水2.5 mL,渦旋3 s,準(zhǔn)確加入上述乙腈提取液2.5 mL,渦旋1 min,在4 ℃以8000 r/min低溫離心5 min,上清液過0.22 μm濾膜,于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.2.3 分析條件

1.2.3.1 色譜條件 色譜柱:C18(2.1×100 mm,2 μm);柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:5 μL;流速:0.3 mL/min;流動(dòng)相:A為0.1%甲酸溶液,B為乙腈。梯度洗脫程序:0～1.0 min,95% A;1.0～2.5 min,95%～75% A;2.5～5.0 min,75% A～40% A;5.0～6.0 min,40% A;6.0～6.1 min,40% A～5% A;6.1～8.0 min,5% A;8.1～10.0 min,95% A。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子(ESI)源;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式檢測(cè);霧化氣溫度:300 ℃;霧化器流速:11 L/min,噴霧電壓:15 psi。其余質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 10種磺胺類物質(zhì)的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass parameters of the ten sulfonamides

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用安捷倫液質(zhì)自帶數(shù)據(jù)處理軟件MassHunter(B.06)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相優(yōu)化

分別比較了水-乙腈、0.1%甲酸溶液-乙腈、0.2%甲酸溶液-乙腈、10 mmol/L乙酸銨溶液-0.1%甲酸-乙腈流動(dòng)相體系梯度洗脫對(duì)10種磺胺類藥物響應(yīng)值和分離度的影響,結(jié)果如圖1,使用水-乙腈梯度洗脫,10種磺胺類藥物的響應(yīng)值和分離度均不佳;使用0.1%甲酸溶液-乙腈、0.2%甲酸溶液-乙腈、10 mmol/L乙酸銨溶液-0.1%甲酸-乙腈梯度洗脫均能有效分離8種磺胺類藥物,其中磺胺鄰二甲氧嘧啶和磺胺甲惡唑分子結(jié)構(gòu)相近未能基線分離,磺胺間二甲氧嘧啶和磺胺喹沙啉分子結(jié)構(gòu)相近未能基線分離。使用0.1%甲酸溶液-乙腈梯度洗脫和使用10 mmol/L乙酸銨溶液-0.1%甲酸-乙腈梯度洗脫10種磺胺類藥物分離度和響應(yīng)強(qiáng)度沒有明顯差異,0.2%甲酸溶液-乙腈梯度洗脫響應(yīng)強(qiáng)度最弱。因?yàn)榛前奉愃幬餅槿鯄A性,在流動(dòng)相中加入少量的甲酸,可以促進(jìn)化合物帶正電荷,但是酸濃度過高,同樣也會(huì)抑制其電離。使用0.1%甲酸溶液-乙腈進(jìn)行梯度洗脫,10種磺胺類藥物的響應(yīng)值增強(qiáng),峰形和分離度得到改善,因此選擇0.1%甲酸溶液-乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫溶液。

圖1 10種磺胺類藥物總離子流圖Fig.1 TIC of 10 sulfonamides standard solution

2.2 組織研磨儀條件優(yōu)化

傳統(tǒng)的渦旋振蕩提取方式,動(dòng)能低,樣品均勻性無法得到保證,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性不好。為了使得樣品研磨更加均勻、充分,樣品重復(fù)性好,保證樣品的重現(xiàn)性、有效性、可比性,組織研磨儀可設(shè)置研磨時(shí)間、研磨速率,保證每次研磨條件的一致性。分別設(shè)置不同研磨速率以及研磨時(shí)間,對(duì)比10種磺胺類藥物的回收率,確定最優(yōu)研磨速率以及研磨時(shí)間。以豬肉為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL(見1.2.1),10種磺胺類藥物的添加量為50 μg/kg。

設(shè)定研磨速率為1000 r/min,研磨時(shí)間分別為0.5、1、1.5、2、3 min,其余步驟按1.2.2進(jìn)行樣品前處理,每個(gè)樣品平行測(cè)定3次,外標(biāo)法定量。結(jié)果見圖2,隨著研磨從0.5 min逐漸升至3 min,10種磺胺類藥物的平均回收率呈現(xiàn)逐漸增大再回落的趨勢(shì),研磨時(shí)間為2 min時(shí),10種磺胺類藥物的平均回收率最高,研磨時(shí)間為3 min時(shí),10種磺胺類藥物的平均回收率略有降低。因?yàn)閯?dòng)物組織隨著研磨時(shí)間增長(zhǎng),細(xì)胞破碎越充分,細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)等物質(zhì)大量釋放,不利于磺胺類藥物的提取。

圖2 不同研磨時(shí)間對(duì)10種磺胺類藥物回收率的影響Fig.2 Effects of different grinder timeon the recoveries of ten sulfonamides

設(shè)定研磨時(shí)間為2 min,研磨速率分別為500、800、1000、1200、1400、1600 r/min(最大速率1750 r/min),其余步驟按1.2.2進(jìn)行樣品前處理,每個(gè)樣品平行測(cè)定3次,外標(biāo)法定量。豬肉在不同研磨速率下均可研磨呈肉糜狀,豬肉提取液隨著研磨速率升高,組織破碎越細(xì)膩均勻,顏色越淺,結(jié)果見圖3。研磨速率從500 r/min提高至1600 r/min時(shí),10種磺胺類藥物回收率呈現(xiàn)整體緩慢增大之后保持平穩(wěn)的趨勢(shì)。研磨速率提高至1000 r/min時(shí),10種磺胺類藥物的平均回收率最高,研磨速率從1000 r/min提高至1600 r/min,回收率維持在穩(wěn)定水平,說明當(dāng)研磨速率提升至1000 r/min時(shí),豬肉組織已研磨均勻,豬肉組織達(dá)到平衡狀態(tài),因此選擇1000 r/min作為最適宜研磨速,如圖3所示。

圖3 不同研磨速率對(duì)10種磺胺類藥物回收率的影響Fig.3 Effects of different grinder rateson the recoveries of ten sulfonamides

2.3 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

本試驗(yàn)采用空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)校正法進(jìn)行校正,使標(biāo)準(zhǔn)品和樣品在質(zhì)譜電噴霧接口處具有一致的離子化條件,可以有效的消除基質(zhì)效應(yīng),確保定量結(jié)果的準(zhǔn)確性相同濃度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)樣3針,化合物的基質(zhì)效應(yīng)(ME)=基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)平均響應(yīng)值/溶劑標(biāo)準(zhǔn)平均響應(yīng)值[22]。若ME>1.0,則表示基質(zhì)對(duì)分析物的響應(yīng)產(chǎn)生增強(qiáng)效應(yīng);ME<1.0則表示基質(zhì)對(duì)分析物的響應(yīng)產(chǎn)生抑制;ME=1.0,則表示不存在基質(zhì)效應(yīng)[23-25]。ME偏離1.0的程度越大基質(zhì)效應(yīng)越強(qiáng),ME越接近1.0,基質(zhì)效應(yīng)越小。

2.3.1 不同磺胺類藥物濃度基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià) 本試驗(yàn)以豬肉為研究對(duì)象,采用組織研磨-QuEChERS前處理方法,考察了不同濃度的磺胺類藥物的基質(zhì)效應(yīng),制備基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度的溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線,對(duì)比濃度分別為2、5、10、20、50、100 μg/L六個(gè)濃度水平溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線基質(zhì)效應(yīng)的差異(對(duì)應(yīng)的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度為10、25、50、100、250、500 μg/kg)。結(jié)果如圖4所示,磺胺氯噠嗪(SCP)在不同濃度下均表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng),磺胺間甲氧嘧啶(SMM)在不同濃度下均表現(xiàn)為基質(zhì)抑制,其他8種磺胺類藥物在同一濃度水平下基質(zhì)效應(yīng)差異不明顯。隨著目標(biāo)化合物濃度增大,多數(shù)化合物基質(zhì)效應(yīng)隨之減小,整體呈現(xiàn)出低濃度基質(zhì)增強(qiáng),高濃度基質(zhì)抑制的趨勢(shì)?？赡苁且?yàn)樨i肉含有大量蛋白質(zhì)和脂肪等成分,與磺胺類藥物共流出,導(dǎo)致顯著的基質(zhì)效應(yīng)。藥物濃度小于10 μg/L時(shí)(對(duì)于的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度為50 μg/kg),基質(zhì)效應(yīng)顯著增強(qiáng)。隨著藥物濃度增大,基質(zhì)相對(duì)目標(biāo)化合物的濃度降低,爭(zhēng)奪離子能力降低,基質(zhì)效應(yīng)降低并趨于穩(wěn)定,但部分藥物由基質(zhì)增強(qiáng)變?yōu)榛|(zhì)抑制,初步推測(cè)可能和藥物性質(zhì)有關(guān),目前暫無報(bào)道,有待進(jìn)一步研究。

圖4 不同濃度磺胺類藥物對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響Fig.4 Effects of different concentrationonthe matrix effect of ten sulfonamides

2.3.2 不同樣品基質(zhì)基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià) 本試驗(yàn)基于不同樣品基質(zhì)對(duì)分析結(jié)果的影響進(jìn)行研究,以豬肉、牛奶、雞蛋三種動(dòng)物源食品作為研究對(duì)象,添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,10種磺胺類藥物的添加量分別為10、25、50、100、250、500 μg/kg,采用組織研磨-QuEChERS前處理方法,選取其中高中低3個(gè)濃度點(diǎn)(10、50、250 μg/kg),以確定其基質(zhì)效應(yīng)。如表2所示,待測(cè)物濃度較低時(shí)(低于50 μg/kg),基質(zhì)效應(yīng)顯著增強(qiáng),且豬肉的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)高于牛奶和雞蛋,牛奶和雞蛋的基質(zhì)效應(yīng)相當(dāng)。待測(cè)物濃度較高時(shí)(高于50 μg/kg),基質(zhì)效應(yīng)減弱,且豬肉、牛奶和雞蛋的基質(zhì)效應(yīng)相當(dāng)。

表2 動(dòng)物源食品中磺胺類藥物在UPLC-MS/MS檢測(cè)下的基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Matrix effects for UPLC-MS/MS analysis of sulfonamides in animal-originated goods

豬肉中蛋白質(zhì)和脂肪含量高于牛奶和雞蛋,碳水化合物含量低于牛奶和雞蛋,推測(cè)親脂性成分的存在可能是造成磺胺類藥物測(cè)定基質(zhì)效應(yīng)的重要原因。在同一添加濃度下10種磺胺類藥物中磺胺間甲氧嘧啶在不同樣品基質(zhì)中差異明顯,不同基質(zhì)間的差異使用(最大值-最小值)/平均值進(jìn)行計(jì)算,其他9種磺胺類藥物在不同基質(zhì)間的差異在20%以內(nèi)。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 方法的線性范圍及檢出限 稱取豬肉陰性樣品,加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量,按1.2.2進(jìn)行前處理,結(jié)果表明,10種磺胺類藥物在質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,R2均大于0.99,以3倍信噪比計(jì)算檢出限(LOD),10倍信噪比計(jì)算定量限(LOQ),結(jié)果見表3。方法檢出限以及定量限均低于已有文獻(xiàn)的報(bào)道[2,7,9]。

表3 10種磺胺類藥物的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table 3 Regression equation,correlation coefficient of 10 sulfonamides

2.4.2 方法回收率以及精密度 稱取豬肉陰性樣品,加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量,按1.2.2進(jìn)行前處理,進(jìn)行回收率和精密度實(shí)驗(yàn)。10種磺胺類藥物的添加量分別為10、50、250 μg/kg,每個(gè)濃度水平作6個(gè)加標(biāo)實(shí)驗(yàn),使用基質(zhì)標(biāo)匹配,考察其回收率以及精密度。結(jié)果表明使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線,能夠有效的降低基質(zhì)效應(yīng),獲得了良好的回收率和精密度,平均回收率在89.4%～111.0%之間,精密度在0.8%～4.9%之間,結(jié)果見表4。

表4 豬肉中10種磺胺類藥物的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 4 Recoveries and relative standard deviations(RSDs)of 10 sulfonamides in pork(n=6)

2.5 實(shí)際樣品分析

利用該方法對(duì)蘭州市場(chǎng)銷售的500批次畜禽肉、牛奶和雞蛋進(jìn)行檢驗(yàn),共有11批豬肉樣品檢出磺胺二甲嘧啶,選取其中1批豬肉,使用國標(biāo)方法和本方法同時(shí)檢測(cè),結(jié)果見表5,GB/T 21316-2007檢出限較高,結(jié)果為未檢出,農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-23-2008和本試驗(yàn)方法檢測(cè)值的相對(duì)誤差為7.5%,該方法簡(jiǎn)化了國標(biāo)的前處理方法,操作簡(jiǎn)單,靈敏度高,適用于動(dòng)物源食品中磺胺類藥物的檢測(cè)。

表5 本實(shí)驗(yàn)方法與其他測(cè)定肉類食品中磺胺類藥物方法的比較Table 5 Comparison of this method with other methods for the determination of SAs in meat product

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用組織研磨-QuEChERS技術(shù)結(jié)合三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀,對(duì)動(dòng)物源性食品中的磺胺類藥物進(jìn)行分析檢測(cè),方法可行。使用組織研磨儀能夠有效提取目標(biāo)化合物,具有高通量、重復(fù)性好、方法回收率高、節(jié)約體力等特點(diǎn),通過基質(zhì)效應(yīng)分析,適用于動(dòng)物源性食品中磺胺的檢測(cè)。動(dòng)物源性食品基質(zhì)復(fù)雜,組織研磨-QuEChERS技術(shù)在檢測(cè)低濃度樣品時(shí)(低于50 μg/kg)有明顯的基質(zhì)效益,今后的研究應(yīng)深入探尋化合物組成與基質(zhì)效應(yīng)的關(guān)系,部分藥物濃度由低到高,其基質(zhì)效益由基質(zhì)增強(qiáng)變?yōu)榛|(zhì)抑制,初步推測(cè)可能和藥物性質(zhì)有關(guān),有待進(jìn)一步研究。