蘇 偉,萬 聆,簡素平,黃立山,陳 鋼,*

(1.江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江西南昌 330013; 2.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047)

桑屬桑科植物是我國傳統(tǒng)的藥食兩用植物,在亞洲多個國家廣泛種植[1-2]。千百年來,由于其葉子的低毒性和生物活性(如抗高血壓[3]、抗高血糖[4-5]、抗凝血[6]等),被中醫(yī)作為一種用來治療疾病的草藥。隨著桑葉活性成分的深入研究,發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物是桑葉中重要的活性成分[7-8],并對桑葉的藥理功效起著關(guān)鍵性的作用。我國桑樹資源豐富,而桑葉在我國大多是作為蠶的食物,有關(guān)桑葉的深加工不多,有效成分的利用程度不夠[9-10]。因此,將桑葉中的有效成分提取純化,實(shí)現(xiàn)其高價值利用成為研究熱點(diǎn)。

目前,對于桑葉黃酮提取工藝的研究主要有傳統(tǒng)溶劑提取[11]、超聲波輔助提取[12]、微波輔助提取[13]、超臨界CO2提取[14]等。超聲波是一種空化機(jī)械波,其產(chǎn)生的空化效應(yīng)可以加速活性物質(zhì)的溶出[15],運(yùn)用超聲輔助提取天然活性物質(zhì)不僅可以提高得率,還能避免提取溫度過高而對活性物質(zhì)產(chǎn)生破壞作用,還具有縮短提取時間的作用[16-17],超聲輔助提取法還可以減少有機(jī)試劑的使用量,具有一定的環(huán)保效果[18]。

因此,本研究以霜桑葉為材料,研究乙醇濃度、料液比、超聲時間和超聲溫度對桑葉黃酮提取率的影響,通過Design-Expert試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析法對桑葉黃酮超聲輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,并運(yùn)用AB-8型大孔樹脂對粗提物進(jìn)行純化,以期提高桑葉黃酮的提取率與純度,增加桑葉黃酮提取物的活性,為桑葉產(chǎn)業(yè)的綜合利用和桑葉黃酮的進(jìn)一步開發(fā)提供一定理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑葉 亳州市京皖中藥飲片廠,烘干后粉碎過40目篩;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 Solarbio科技有限公司;過氧化氫、亞硝酸鈉、無水乙醇、硝酸鋁、氫氧化鈉 均化學(xué)純,西隴化工有限公司;AB-8大孔樹脂 天津波鴻樹脂有限公司。

UV-2000型紫外可見分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司;TDZ5-MS自動平衡離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;鼓風(fēng)干燥箱 精宏設(shè)備實(shí)驗(yàn)有限公司;SB-5200DT超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;DHL-A 恒流泵、DBS-100全自動部分收集器 上海青浦滬西儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程 桑葉→粉碎、過篩→超聲輔助提取→乙醇醇沉4次→過大孔樹脂純化→旋轉(zhuǎn)濃縮→冷凍干燥→桑葉總黃酮

桑葉經(jīng)溫度65 ℃,時間6 h烘干后,粉碎過40目篩,在條件為超聲波輸出功率為450 W超聲處理75 min,超聲溫度40 ℃,乙醇濃度80%,料液比1∶30 g/mL的條件下進(jìn)行提取桑葉總黃酮,按1∶8 g/mL加入無水乙醇醇沉,醇沉?xí)r間12 h,醇沉4次。然后用AB-8型大孔樹脂純化。將得到的洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)至無乙醇味,再經(jīng)冷凍干燥得到總黃酮。

1.2.2 總黃酮的測定 準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg,用60%乙醇溶解于50 mL容量瓶,得到200 mg/L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液置于6根20 mL試管中,加入3 mL 60%乙醇溶液,分別再加入1 mL 5% NaNO2溶液,搖勻。6 min后加入1 mL 10% Al(NO3)3溶液,搖勻,靜置6 min后加入4% NaOH溶液4 mL,再加60%乙醇定容至10 mL,搖勻,靜置15 min后在510 nm處測定吸光度值[19-20]。根據(jù)測得數(shù)據(jù)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=12.436x-0.0035,R2=0.9995,式中x為蘆丁濃度(mg/mL),y為吸光度。

提取完成后真空抽濾,將濾液定容到250 mL的容量瓶中,按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定黃酮含量并計(jì)算得率。

式中:A:測定黃酮提取液的吸光度;m:桑葉粉末質(zhì)量(g);b:標(biāo)準(zhǔn)曲線方程縱截距;a:標(biāo)準(zhǔn)曲線方程橫截距。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 乙醇濃度對桑葉總黃酮得率的影響 稱取1 g桑葉,設(shè)置超聲波輸出功率為450 W,在超聲時間70 min、超聲溫度40 ℃、料液比1∶30 g/mL條件下,測定乙醇濃度在40%、50%、60%、70%、80%、90%的條件下桑葉總黃酮的得率。

1.2.3.2 料液比對桑葉總黃酮得率的影響 稱取1 g桑葉,設(shè)置超聲波輸出功率為450 W,在乙醇濃度70%、超聲時間70 min、超聲溫度40 ℃條件下,測定料液比在1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45 g/mL的條件下桑葉總黃酮的得率。

1.2.3.3 超聲時間對桑葉總黃酮得率的影響 稱取1 g桑葉,設(shè)置超聲波輸出功率為450 W,在乙醇濃度70%、料液比1∶30 g/mL、超聲溫度40 ℃條件下,測定超聲時間在40、50、60、70、80、90 min的條件下桑葉總黃酮的得率。

1.2.3.4 超聲溫度對桑葉總黃酮得率的影響 稱取1 g桑葉,設(shè)置超聲波輸出功率為450 W,在乙醇濃度70%、料液比1∶30 g/mL、超聲時間70 min條件下,測定超聲溫度在30、35、40、45、50、55 ℃的條件下桑葉總黃酮的得率。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以乙醇濃度(A)、料液比(B)、超聲時間(C)和超聲溫度(D)4個因素作為提取工藝的影響因子,以總黃酮得率為考察指標(biāo),采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,對桑葉總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,并找出最佳工藝條件[21-22]。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Response surface test factor level

1.2.5 大孔樹脂純化 取預(yù)處理好的AB-8型大孔樹脂,裝入26 mm×300 mm的層析柱。在上樣pH為4.24、上樣流速為2 mL/min、洗脫液為70%乙醇、洗脫液流速為2 mL/min的條件下進(jìn)行純化[23-24]。將得到的洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)至無乙醇味,再經(jīng)冷凍干燥得到總黃酮。

1.2.6 桑葉總黃酮對過氧化氫的清除作用 取2 mL濃度為800 μmol/L的過氧化氫(在磷酸鉀緩沖液pH=7.42中制備)與2 mL不同濃度(濃度分別是10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%)的桑葉黃酮混合,并將混合液在室溫下靜置10 min在230 nm處測量吸光度,采用以下公式計(jì)算對過氧化氫的清除率[25]:

式中:A樣品:添加桑葉黃酮在560 nm吸光度;A對照:添加過氧化氫在560 nm吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

響應(yīng)面設(shè)計(jì)采用Design Expert V8.0.5統(tǒng)計(jì)分析軟件,圖形制作采用Excel和Origin Pro 8.0數(shù)據(jù)處理軟件(n=3)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對桑葉總黃酮得率的影響 如圖1所示,桑葉總黃酮的得率隨乙醇濃度的增大先增大而后減小,在乙醇濃度為80%的時候達(dá)到最大。當(dāng)乙醇濃度超過80%,乙醇濃度繼續(xù)增加則導(dǎo)致提取率降低。原因可能是高濃度的乙醇溶液會增大整個提取體系的粘度,不僅降低總黃酮的析出,還會增大其他雜質(zhì)的析出[26]。

圖1 乙醇濃度對桑葉總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on theextraction rate of total flavonoids from mulberry leaves

2.1.2 料液比對桑葉總黃酮得率的影響 如圖2所示,在料液比小于1∶30 g/mL時,得率隨著料液比的增大而增大。當(dāng)料液比超過1∶30 g/mL時,得率則出現(xiàn)下降的趨勢。原因可能是在1∶30 g/mL的時候總黃酮的析出趨于穩(wěn)定,繼續(xù)增加溶劑會提高其他雜質(zhì)的析出[27]。

圖2 料液比對桑葉總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ratio of material to liquid onextraction rate of total flavonoids from mulberry leaves

2.1.3 超聲時間對桑葉總黃酮得率的影響 如圖3所示,桑葉總黃酮的得率先增大后減小,在70 min的時候得率達(dá)到最大值,而后隨著時間的增加得率逐漸降低。原因可能是在70 min后,由于提取時間的過長,有部分黃酮發(fā)生了氧化反應(yīng)降低了總黃酮的含量[28]。

圖3 超聲時間對桑葉總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on theextraction rate of total flavonoids from mulberry leaves

2.1.4 超聲溫度對桑葉總黃酮得率的影響 如圖4所示,以40 ℃為拐點(diǎn),桑葉總黃酮得率先隨著溫度的升高而增大,然后隨著出現(xiàn)降低的現(xiàn)象。降低的原因可能是隨著溫度的提高加大了反應(yīng)體系中可溶性蛋白的變性,使得整個體系的黏度增大,影響了黃酮類物質(zhì)的溶出[29]。

圖4 超聲溫度對桑葉總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on theextraction rate of total flavonoids from mulberry leaves

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)Design-Expert軟件設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方案,如表2所示。以乙醇濃度(A)、料液比(B)、超聲時間(C)、超聲溫度(D)為變量,以桑葉總黃酮的得率(Y)為響應(yīng)值,進(jìn)行擬合分析。得到的擬合方程式為:

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of response surface

Y=2.64+0.082A+0.1B+0.2C+0.14D-0.068AB-0.078AC-0.023AD-0.025BC-0.085BD-0.092CD-0.22A2-0.13B2-0.19C2-0.15D2。

表3 響應(yīng)面方差分析結(jié)果Table 3 Response surface variance analysis

由圖5可知,料液比和超聲溫度、超聲時間和超聲溫度的交互作用對響應(yīng)值的影響顯著;料液比和乙醇濃度、料液比和超聲時間、料液比和超聲溫度、乙醇濃度和超聲時間交互作用對響應(yīng)值的影響不顯著;各單因素與桑葉總黃酮的得率都呈二次拋物線關(guān)系,表明擬合的回歸方程較好。

圖5 各因素兩兩相交作用的響應(yīng)面Fig.5 Response surface of interaction of two various factors

2.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 通過Design Expert V8.0.5統(tǒng)計(jì)分析軟件,對該桑葉總黃酮提取的模型進(jìn)行預(yù)測,得到最佳提取工藝為:乙醇濃度80.57%,料液比1∶31.28 g/mL,超聲時間74.32 min,超聲溫度41.24 ℃,理論得率為2.7%?？紤]實(shí)際條件將其工藝優(yōu)化為:乙醇濃度80%,料液比1∶30 g/mL,超聲時間75 min,超聲溫度40 ℃。重復(fù)進(jìn)行三次試驗(yàn)所得的得率結(jié)果為2.7%,與理論預(yù)測值相同,說明該模型的擬合程度較好。

2.3 大孔樹脂純化桑葉總黃酮

使用AB-8型大孔樹脂對粗提物進(jìn)行純化,桑葉粗提取粉末中的總黃酮含量為12.3 mg/mL,純化后總黃酮的含量提高至33.8 mg/mL。粗提液流經(jīng)大孔樹脂,大孔樹脂會吸附粗提物中的各種成分。通過水洗和醇洗的方式,將各種成分進(jìn)行分離純化,進(jìn)而提高了提取物中總黃酮的含量[30-31]。

2.4 桑葉總黃酮對過氧化氫的清除作用

過氧化氫可以穿過膜并且在金屬離子的存在下氧化許多生物分子并形成羥基。因此,金屬螯合和過氧化氫清除過程對于生物體具有重要意義[32-33]。由圖6可以看出,桑葉總黃酮和VC都具有較好的清除過氧化氫的能力,桑葉總黃酮的IC50為(45±0.8) μg/mL,而VC的IC50=(80.46±1.4) μg/mL,桑葉總黃酮的清除過氧化氫的能力大于VC。

圖6 桑葉總黃酮及VC對過氧化氫的清除作用Fig.6 Scavenging effects of mulberry leaftotal flavonoids and VC on hydrogen peroxide

3 結(jié)論

桑葉總黃酮超聲輔助提取最佳工藝參數(shù)為乙醇濃度80%、料液比1∶30 g/mL、超聲時間75 min、超聲溫度40 ℃,在此條件下,桑葉總黃酮得率為2.7%,經(jīng)AB-8大孔樹脂洗脫純化后,純度達(dá)33.8%。純化后桑葉總黃酮抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,桑葉總黃酮的抗氧化能力大于抗壞血酸。相比傳統(tǒng)醇提取法,超聲波輔助提取使桑葉黃酮得率提高0.8%,該結(jié)論為天然抗氧化劑的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。