朱曉蓉 楊芳遠(yuǎn) 盧 晶 曹 曦 楊光燃 謝榮榮 馮建萍 楊金奎*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科,北京 100730； 2.糖尿病防治研究北京市重點實驗室，北京 100730； 3.北京市糖尿病研究所，北京 100730)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病最具特征性的微血管合并癥，是我國成年人致盲的常見原因和首要原因，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。研究[2]顯示，糖尿病病史15～20年，幾乎所有的1型糖尿病和60%以上的2型糖尿病患者有視網(wǎng)膜病變。威斯康星糖尿病視網(wǎng)膜病變流行病學(xué)研究(Wisconsin Epidemiological Study of Diabetic Retinopathy，WESDR)表明，3.6%的1型糖尿病患者在年輕時和1.6%的2型糖尿病患者在晚期時被診斷為法定盲。我國糖尿病人群居世界第一，目前成年糖尿病患者超過1億[3]，據(jù)此推算，我國因糖尿病視網(wǎng)膜病變所致的法定盲患者將超過160萬人。因此，早期發(fā)現(xiàn)和干預(yù)具有重要的臨床意義。

糖尿病視網(wǎng)膜病變是由基因與環(huán)境因素綜合作用的代謝性疾病。而且越來越多的證據(jù)[4]表明，糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生與“代謝記憶”有關(guān)。早期高血糖暴露引起的表觀遺傳修飾，即使血糖控制良好后也會發(fā)生糖尿病合并癥[5]。近年來，代謝組學(xué)技術(shù)的發(fā)展也為探索糖尿病視網(wǎng)膜病變生物標(biāo)志物研究提供了新的思路。曾有代謝組學(xué)研究[4,6]用于探索早期糖尿病視網(wǎng)膜病變的血液“代謝圖譜”。而本研究擬在發(fā)生威脅視力的糖尿病視網(wǎng)膜病變——增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy, PDR)的2型糖尿病患者中，采用代謝組學(xué)檢測，探索增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變的“代謝圖譜”，探討與其發(fā)生發(fā)展可能相關(guān)的機(jī)制。

1 對象與方法

1.1 研究對象

以2016-2017年間在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科及眼科門診就診的1 024名2型糖尿病患者為研究對象，選擇其中增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變者為病例組(PDR組)，根據(jù)性別、年齡組間匹配的原則，選擇糖尿病病程10年以上且眼底完全正常(non-diabetic retinopathy, NDR)者為對照組(NDR組)，每組各21例。納入標(biāo)準(zhǔn)：2型糖尿病患者；年齡40～75歲；糖化血紅蛋白(hemoglobin A1c,HbA1c)≥7.5%。排除標(biāo)準(zhǔn)：1型糖尿病和分型不明確的糖尿病患者；合并其他眼部疾病或伴有眼部合并癥的全身系統(tǒng)疾病的患者；嚴(yán)重肝腎功能、心臟功能受損的患者；惡性腫瘤及有器官移植病史的患者。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床信息采集

對所有受試者登記臨床信息并完善體格檢查，包括身高、體質(zhì)量、年齡、性別、糖尿病病程、吸煙史、血壓、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)等。同時采集血液和尿液進(jìn)行實驗室檢測，包括空腹血糖、總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇、血清肌酐、肝功能、糖化血紅蛋白及尿微量白蛋白等。

1.2.2 血清樣本制備

過夜禁食至少8 h，采用K2EDTA抗凝管抽取4 mL外周血，冰上靜置30 min后，4° 1 000g離心機(jī)離心10 min，提取血清。所有血清標(biāo)本-80 ℃冰箱凍存直到研究使用。

1.2.3 眼底檢查

采用拓普康TRC-NW7SF (Topcon Co., Tokyo公司,日本)眼底照相儀，所有受試者均接受眼底照相檢查，眼底照相結(jié)果均由兩名首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院眼科醫(yī)師按2002年國際糖尿病視網(wǎng)膜病變臨床分級標(biāo)準(zhǔn)[7]進(jìn)行分級評估。(i)無明顯視網(wǎng)膜病變(NDR)：無異常改變；(ii) 輕度非增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變(non-proliferative diabetic retinopathy, NPDR)：僅有微動脈瘤；(iii)中度NPDR：介于輕度及重度NPDR的表現(xiàn)；(iv)重度NPDR：出現(xiàn)下列任何1個改變，但無PDR表現(xiàn)：任一象限內(nèi)多于20處視網(wǎng)膜內(nèi)出血；兩個以上象限有靜脈串珠樣改變；1個象限有顯著的微血管內(nèi)微血管異常；(v)增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變：出現(xiàn)1種或多種改變，包括新生血管形成、玻璃體積血或視網(wǎng)膜前出血。

1.2.4 液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)代謝組檢測

取血清100 μL，加入3倍體積乙腈，渦旋震蕩混合1～3 min，4 ℃靜置10 min，13 000 r/min離心10 min，取上清，真空干燥即可。100 μL乙腈復(fù)溶，待檢。采用電噴霧電離源，正離子電離模式。離子源溫度120 ℃，脫溶劑溫度 500 ℃, 脫溶劑氮氣流600 L/h，錐孔反吹氮氣 50 L/h。正離子模式毛細(xì)管電離電壓分別為3.0 kV，取樣錐孔電壓為27 eV，萃取錐孔 4 eV，四極桿掃描范圍50～1 500 m/z。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

1.3.1 臨床資料統(tǒng)計

1.3.2 代謝組結(jié)果統(tǒng)計

使用MarkerView進(jìn)行峰識別、峰過濾、峰對齊工作。利用MetaboAnalyst 4.0 (http://www.metaboanalyst. ca/MetaboAnalyst/)將樣本進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理；進(jìn)行偏最小二乘法(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)多元分析發(fā)現(xiàn)組間的差異代謝物；采用倍數(shù)變化和t檢驗相結(jié)合的方法計算火山圖。再用組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的峰進(jìn)行多元模式識別確定上調(diào)或下調(diào)峰。再用這些數(shù)據(jù)進(jìn)行箱形圖分析、聚類分析和代謝途徑分析。

差異代謝產(chǎn)物應(yīng)用Metaboanalyst (http://www.metaboanalyst.ca/)進(jìn)行路徑和可視化分析。差異代謝物篩選根據(jù)差異倍數(shù)(fold change,FC)、P值和變量重要性投影值(variable important in the projection, VIP)設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)。篩選的差異代謝物與人類代謝組數(shù)據(jù)庫(Human Metabolism Database,HMDB)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，確定具體物質(zhì)[8]。

利用KEGG數(shù)據(jù)庫對差異化合物進(jìn)行Pathway分析，并且用統(tǒng)計檢驗的方法計算每個Pathway條目中差異化合物富集的顯著性。計算的結(jié)果會返回一個富集顯著性的P值，小的P值表示差異化合物在該Pathway 中出現(xiàn)了富集。

圖1 PLS-DA散點得分圖Fig.1 Score plots of PLS-DA models The two groups were well separated in the PLS-DA score plot, indicating that they had markedly different metabolic characteristics;PLS-DA：partial least squares discriminant analysis.

2 結(jié)果

2.1 兩組患者臨床特征比較

PDR組與NDR組患者臨床特征詳見表1。兩組間年齡、性別、BMI、低密度脂蛋白膽固醇濃度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。NDR組糖化血紅蛋白濃度高于PDR組，PDR組合并蛋白尿的患者數(shù)高于NDR組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 兩組患者臨床特征表

ItemNDR(n=21)PDR(n=21)tPGender (male/female)9/129/12 0.00?1.000Age/a53.8±6.851.6±7.70.850.404Duration/a15(11.5,20)11(8,15.5)2.690.014BMI/(kg·m-2)26.98±3.4026.22±2.591.440.164LDL-C/(mmol·L-1)2.83±0.952.82±0.960.380.709FBG/(mmol·L-1)8.15±2.748.95±2.86-0.140.892HbA1c/%9.38±1.208.14±0.642.800.011Albuminuria515-3.55?0.002Microalbuminuria 20-200 ng/min48 >200 ng/min17

*χ2value;NDR: non-diabetic retinopathy;PDR:proliferative diabetic retinopathy;BMI: body mass index;LDL-C:low density lipoprotein cholesterol;FBG: fasting blood glucose;HbA1c: hemoglobin A1c.

2.2 差異代謝物分析

對獲得代謝物質(zhì)進(jìn)行正交PLS-DA模型分析顯示兩組的代謝差異，得分圖見圖1。建立的PLS-DA模型能夠很好地區(qū)分PDR組和NDR組。進(jìn)一步將差異代謝物繪制火山圖及熱圖(圖2)，結(jié)果均表明PDR與NDR組相比存在明顯不同的代謝特征。按照FC>2或FC<0.5，P<0.05且VIP>1，篩選出的差異化合物與HMDB數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，共鑒定出136個差異代謝物質(zhì)，其中包括有機(jī)酸(78%)，有機(jī)氮化合物(4%)，脂類及類脂分子(3%)及其他代謝物(圖3)。表2展示10個變化顯著的代謝物。

圖2 差異代謝物繪制火山圖(A)和熱圖(B)Fig.2 The volcanic map (A) and heat map (B) of the different metabolites were plottedThere were significantly different metabolic characteristics in the PDR group compared with the NDR group;NDR: non-diabetic retinopathy; PDR:proliferative diabetic retinopathy.

圖3 差異代謝物分類 Fig.3 Metabolite classification analysisPie chart of differentially metabolomic showed that the 136 metabolites mainly involved organic compounds (78%), organoheterocyclic compounds (4%), lipids and lipid-like molecules (3%) and others.

表2 與增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變相關(guān)的差異代謝物

HMDB:Human Metabolism Database.

2.3 代謝通路分析

代謝差異物在30條KEGG通路中富集(圖4A)，其中3條通路顯著富集(P<0.05)。這3條通路分別為硫代謝、鞘脂代謝以及半胱氨酸和蛋氨酸代謝(圖4B～D)。

圖4 代謝通路分析Fig.4 Non-targeted metabolomics pathway analysisA:Pathway enrichment analysis. The size and color of each circle was based on pathway impact value and P-value, respectively; B-D: Three pathways differ between the NDR and PDR group, particularly, in Sulfur metabolism (B), Sphingolipid metabolism (C) and Cysteine and methionine metabolism(D); NDR: non-diabetic retinopathy; PDR:proliferative diabetic retinopathy.

3 討論

糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病最具特征性的微血管合并癥，是成人發(fā)生失明的常見原因，也是不可逆性盲的首要原因[1]。糖尿病視網(wǎng)膜病變分為非增殖期視網(wǎng)膜病變和增殖期視網(wǎng)膜病變。其中增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變也被定義為威脅視力的糖尿病視網(wǎng)膜病變，極易導(dǎo)致視力喪失，降低患者生存質(zhì)量。早期發(fā)現(xiàn)和干預(yù)具有極其重要的意義。糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生機(jī)制與高血糖所致持續(xù)性代謝性紊亂、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激或其他未知致病因子有關(guān)[9]。一個不爭的事實是，一些血糖控制達(dá)標(biāo)的患者也出現(xiàn)了增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變。因此，有研究者[10]認(rèn)為盡管血糖是視網(wǎng)膜病變進(jìn)展的主要的系統(tǒng)性風(fēng)險因素，但它的整體貢獻(xiàn)只有11%，也就是說，風(fēng)險的89%必須由其他未知因素來解釋。本研究采用液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)探索增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血清中代謝失調(diào)的特征。本研究目的包括：(1)檢測威脅視力的糖尿病視網(wǎng)膜病變-增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變的“代謝圖譜”; (2)探索可能與增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生發(fā)展相關(guān)的代謝通路。

迄今為止，僅有4項關(guān)于糖尿病視網(wǎng)膜病變的代謝組學(xué)研究，而根據(jù)研究標(biāo)本類型可以分為玻璃體和血漿。但是玻璃體標(biāo)本取樣具有侵襲性、取樣受限，而血漿/血清易于獲得，依然是目前開展臨床篩查常用的生物樣品。因此，2016年Chen等[4]首次采用氣相色譜技術(shù)對40例非增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變患者的血漿進(jìn)行代謝組學(xué)檢測，共檢測14個差異代謝物，而葡糖酸水平顯著升高可能作為潛在的診斷標(biāo)志物。與氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)相比，本研究采用液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)提高了檢測靈敏度，共檢測出146個差異代謝物。其中差異代謝物-犬尿酸(kynurenic acid)在既往研究[6]中也被報道與糖尿病視網(wǎng)膜病變相關(guān)，可能與氧化應(yīng)激有關(guān)，但具體機(jī)制尚未明確。

早期2項玻璃體標(biāo)本的代謝組學(xué)研究[11-12]報道增殖期糖尿病患者的玻璃體液的精氨酸代謝[11]、多元醇途徑和抗壞血酸代謝紊亂[12]。Chen等[4]進(jìn)行的血清代謝組學(xué)研究結(jié)果則顯示非增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血清中磷酸戊糖代謝途徑顯著富集，磷酸戊糖代謝途徑紊亂可能與非增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變相關(guān)。本研究通過增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血清代謝組檢測，發(fā)現(xiàn)差異代謝物硫代謝、鞘脂代謝以及半胱氨酸和蛋氨酸代謝通路顯著富集，推測上述代謝途徑紊亂可能與增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。蛋氨酸是重要的必需氨基酸，參與機(jī)體重要的代謝過程。有研究者[13]認(rèn)為蛋氨酸代謝紊亂可以通過氧化應(yīng)激途徑引起腎臟功能損傷。發(fā)生機(jī)制與影響蛋氨酸代謝通路中的甲硫氨酸亞砜還原酶A(MsrA)和B(MsrB)活性有關(guān)[14]。而正常人視網(wǎng)膜中也已被證實存在MsrA[15]，因此筆者首次提出蛋氨酸代謝途徑紊亂可能也是通過影響MsrA功能參與增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變的進(jìn)程?？偠灾?，不同眼底分期的血清“代謝圖譜”存在差異，提示增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變可能存在獨特的代謝過程。因此，需要更多的研究來驗證這些結(jié)論并探討與糖尿病視網(wǎng)膜病變之間的關(guān)聯(lián)。

采用代謝組學(xué)研究糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制具有很大的優(yōu)勢，目前處于起始階段，相關(guān)報道很少，結(jié)果重復(fù)性差，需要更多的研究來驗證這些結(jié)論并探討與糖尿病視網(wǎng)膜病變之間的關(guān)聯(lián)。本研究為探索性研究，存在一定局限性，小的樣本量不足以做出糖尿病視網(wǎng)膜病變患者代謝狀態(tài)的結(jié)論性陳述，需要增加樣本量和開展隊列研究來證實筆者的發(fā)現(xiàn)，并進(jìn)一步探討可能的機(jī)制。

總之，本研究通過伴有增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變的2型糖尿病患者的血清代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)PDR組與NDR組患者相比具有獨特的代謝特征。提出硫代謝、鞘脂代謝以及半胱氨酸和蛋氨酸代謝紊亂可能與增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。但是本研究結(jié)果仍需要更多的研究來驗證這些結(jié)論并深入探討與糖尿病視網(wǎng)膜病變之間的關(guān)聯(lián)。