馬 超 賀 毅 孫作厘 劉鑫垚 馮正田 陳 沛 寧艷哲 朱 虹 尹冬青 賈竑曉*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安定醫(yī)院 國(guó)家精神心理疾病臨床研究中心 精神疾病診斷與治療北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100088； 2.首都醫(yī)科大學(xué)人腦保護(hù)高精尖創(chuàng)新中心，北京 100069)

精神分裂癥是臨床上常見的精神相關(guān)疾病，中國(guó)精神衛(wèi)生調(diào)查的數(shù)據(jù)[1]顯示，精神分裂癥的加權(quán)終生患病率為0.6%。精神分裂癥好發(fā)于青壯年，為其家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)[2]。從20世紀(jì)50年代氯氮平發(fā)現(xiàn)以來(lái)，精神分裂癥的治療以服用抗精神病類藥物為主，不過(guò)有1/5～2/5的患者有治療抵抗[3]。所以開發(fā)新的治療藥物至為關(guān)鍵。精神分裂癥的病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，腸道微生物群可能通過(guò)“腦腸軸”在精神分裂癥發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用[4]。腸道微生物群可通過(guò)免疫、神經(jīng)內(nèi)分泌和神經(jīng)通路從而影響患者的大腦發(fā)育和行為[5]。最近，中醫(yī)藥治療菌群失調(diào)時(shí)得到了良好的治療效果[6]。石珍安神湯(Shi-Zhen-An-Shen-Tang,SZAST)是首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安定醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合團(tuán)隊(duì)的經(jīng)驗(yàn)方，前期實(shí)驗(yàn)[7]證明其可改善精神分裂模型小鼠社會(huì)交互行為及對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞的低表達(dá)有治療作用。因此，通過(guò)腸道菌群多樣性來(lái)研究石珍安神湯(SZAST)治療精神分裂癥的作用機(jī)制，可為精神分裂癥的治療提供新的方向。

16S rRNA技術(shù)一種高通量測(cè)定方法，常用來(lái)檢測(cè)機(jī)體腸道菌群的多樣性序列[8]。16S rRNA技術(shù)已用于多種精神疾病的研究。一項(xiàng)有關(guān)自閉癥譜系(autism spectrum disorder, ASD)的研究[9]顯示，ASD的定植微生物群可導(dǎo)致自閉行為。有關(guān)帕金森病的研究[10-11]也表明帕金森病患者體內(nèi)的微生物群有別于正常健康對(duì)照組。腸道微生物群可能通過(guò)免疫和炎性反應(yīng)機(jī)制參與了精神分裂癥的發(fā)展[12-13]。為探討腸道菌群失衡與精神分裂癥的內(nèi)在聯(lián)系以及石珍安神湯在菌群治療、靶點(diǎn)研究中的作用和機(jī)制，本研究采取銅腙誘導(dǎo)的脫髓鞘小鼠模型，通過(guò)石珍安神湯治療，對(duì)小鼠回盲部糞便標(biāo)本中的細(xì)菌16S rRNA V3-V4區(qū)域進(jìn)行定性分析。旨在從腸道微生態(tài)層面上探究該復(fù)方的作用機(jī)制，為臨床上精神分裂癥的評(píng)價(jià)與診斷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

30只SPF級(jí)5周齡的雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào): SCXK(京)2016-0011。飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)環(huán)境清潔，晝夜交替 12 h，正常飲食。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批號(hào):AEEI-2018-047)。

1.2 主要藥品

雙環(huán)己酮草酰二腙(cuprizone，CPZ) 購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司; SZAST的各種單藥飲片購(gòu)自北京同仁堂 (大柵欄店)，在首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院制成凍干粉。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組及處理

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)2周后，采用數(shù)字表法隨機(jī)分為6組，每組 5 只，分別為：對(duì)照組(control, C)、模型組(model, M)、中藥低劑量組(low dosage,L)，中藥中劑量組(midium dosage, Z)，中藥高劑量組(high dosage, H)、喹硫平組(quetiapine, Q)。

對(duì)照組正常飲食，其他組食用混合了0.2% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))CPZ的特殊飼料。食用特殊飼料4周后，模型組以 0.9% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 氯化鈉注射液灌胃2周， SZAST組給予SZAST灌胃2周(SZAST的給藥劑量依次為5.5、11.0和16.5 g·kg-1·d-1)。喹硫平組按10 mg·kg-1·d-1喹硫平溶液灌胃，模型組灌胃給予0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液(10 mg·kg-1·d-1)。每周測(cè)量1次小鼠體質(zhì)量。

1.3.2 樣品的制備

小鼠盲腸內(nèi)容物為機(jī)體菌群多樣性最為豐富的部位，末次給藥后用10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))水合氯醛將小鼠麻醉，頸椎脫臼處死后立即取小鼠盲腸的內(nèi)容物，放入凍存管內(nèi)在液氮中速凍，-80 ℃ 超低溫冰箱保存。每組中隨機(jī)選取5個(gè)樣本送到北京華大基因公司進(jìn)行腸道菌群多樣性檢測(cè)。

1.3.3 16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序分析

采用DNA抽提試劑盒對(duì)樣本的基因組 DNA 進(jìn)行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) DNA 的純度和濃度。以稀釋后的基因組 DNA 為模板，使用細(xì)菌16S rRNA(V3-V4)區(qū)域引物,前引物為343F-5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′，后引物為 798R-5′-AGGGTATCTAATCCT-3′進(jìn)行PCR純化和擴(kuò)增。根據(jù)序列比對(duì)采用 pynast (v0.1)軟件對(duì)OTUs代表序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的構(gòu)建。測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理生成優(yōu)質(zhì)序列之后，根據(jù)序列的相似性將序列歸為多個(gè)可操作分類單元(operational taxonomic units, OTUs)。參數(shù)為序列相似度大于或等于97%被歸為一個(gè)OTU單元。用QIIME 軟件包挑選出各個(gè) OTU 的代表序列，并將所有代表序列與Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)注釋。最終對(duì)數(shù)據(jù)信息進(jìn)行alpha 多樣性，beta多樣性，菌群分類學(xué)組成及16S功能基因預(yù)測(cè)分析等一系列的綜合性分析及處理。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠菌群OTU分析

每組5個(gè)樣本進(jìn)行分析得到OTU數(shù)據(jù)，利用花瓣圖的方式呈現(xiàn)。六個(gè)組別共有836個(gè)OTU，對(duì)照組獨(dú)有509個(gè)，模型組獨(dú)有511個(gè)，低濃度組獨(dú)有433個(gè)，中濃度組獨(dú)有473個(gè)，高濃度組獨(dú)有458個(gè)，喹硫平組獨(dú)有499個(gè)(圖1)。

圖1 各組腸道菌群的花瓣圖Fig.1 The flower plot intestinal flora in mice from each groupC:control; M:model;L:low dosage; Z:medium dosage; H:high dosage; Q:quetiapine

2.2 小鼠樣本菌群的alpha多樣性分析

2.2.1 各組樣本腸道菌群香農(nóng)指數(shù)曲線

當(dāng)香農(nóng)指數(shù)為6時(shí)，各樣本從隨機(jī)抽取的測(cè)序條數(shù)發(fā)現(xiàn)的物種趨于飽和(圖2)。

圖2 各組樣本腸道菌群香農(nóng)指數(shù)曲線Fig.2 Shannon of alpha diversity of intestinal flora in mice from each groupC:control; M:model;L:low dosage; Z:medium dosage; H:high dosage; Q:quetiapine

2.2.2 Good’s coverage指數(shù)

該指數(shù)反映測(cè)序深度，本實(shí)驗(yàn)各樣本指數(shù)接近于 1，說(shuō)明測(cè)序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中所有的物種(圖3)。

圖3 各組樣本腸道菌群Good’s coverage指數(shù)Fig.3 Good’s coverage of alpha diversity of intestinal flora in mice from each groupC:control; M:model;L:low dosage; Z:medium dosage; H:high dosage; Q:quetiapine

2.3 小鼠菌群結(jié)構(gòu)beta多樣性分析

采用主成分分析(principal components analysis, PCA)考察小鼠腸道菌群 beta 多樣性的差異。與對(duì)照組比較， 模型組小鼠菌群明顯分開，表明兩組菌群結(jié)構(gòu)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。石珍安神湯低、中、高劑量組與喹硫平組均介于對(duì)照組與模型組中間(圖4)。

圖4 各組小鼠菌群beta多樣性的PCAFig.4 PCA of beta diversity of intestinal flora in mice from each groupC:control; M:model; L:low dosage; Z:medium dosage; H:high dosage; Q:quetiapine; PCA:principal components analysis.

2.4 小鼠樣本菌群分類學(xué)組成分析

根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取每個(gè)樣品在門、綱、目、科、屬、種水平上最大豐度排名前15位的OTU，生成相對(duì)豐度柱形累加圖，以觀察各樣品在不同分類水平上，相對(duì)豐度較高的OTU及其比例，分析顯示，模型組的腸道菌群在門、綱、目、科、屬、種及OTUs層次的菌群種類要少于對(duì)照組(圖5)。綱水平，與對(duì)照組相比，模型組小鼠差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的菌有 1個(gè)，β-變形菌(Beta-proteobacteria)(P<0.05)，且石珍安神湯中高濃度組可顯著回調(diào)該差異(P<0. 05)。目水平，與對(duì)照組相比，模型組小鼠差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的菌有1個(gè)，伯克菌目(Burkholderiales)，且石珍安神湯中高濃度組可顯著回調(diào)該差異(P<0.05)?？扑?，與對(duì)照組相比，模型組小鼠差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的菌有2個(gè)，產(chǎn)堿桿菌科(Alcaligenaceae)和擬桿菌科(Bacteroidales)(P<0.05)。屬水平，與對(duì)照組相比，模型組小鼠差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的菌有1個(gè)，毛螺菌屬-NK4A136(Lachnospiraceae_NK4A136_group)，且給藥組可回調(diào)該差異(圖6)。

圖5 各組小鼠差異菌種的相對(duì)豐度Fig.5 Relative abundance of differences of species of intestinal flora in mice from each groupA:phylum; B:class; C:order; D:family; E:genus; F:species.

2.5 腸道菌群功能預(yù)測(cè)分析

通過(guò)PICRUSt(PhylogeneticInvestigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States，PICRUSt)對(duì)OTU豐度表進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并且比對(duì)每個(gè)OTU的COG(Clusters of Orthologous Groups，COG)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)庫(kù)，獲得OTU對(duì)應(yīng)的COG家族信息和KEGG信息，從而計(jì)算他們的豐度以便進(jìn)一步確定不同組別小鼠的腸道微生物組成的潛在功能變化。

圖6 各組小鼠本菌群具有顯著性差異菌群的相對(duì)豐度Fig.6 Abundance of bacteria with significant differences in intestinal flora of mice from each groupValues were expressed as mean ±SE(n=5,## P<0.01 vs control group; *P<0.05, ** P<0.01 vs model group);A: Beta-proteobacteria; B: Burkholderiales; C: Bacteroidales; D: Alcaligenaceae; E: Lachnospiraceae_NK4A136_group. C:control; M:model; L:low dosage; Z:medium dosage; H:high dosage; Q:quetiapine.

2.5.1 COG功能預(yù)測(cè)

在COG功能預(yù)測(cè)中，對(duì)照組和模型組中菌群功能的離散程度較大，且石珍安神湯給藥組與模型組離散程度大，而喹硫平給藥組接近對(duì)照組(圖7)。

圖7 各組COG功能預(yù)測(cè)圖Fig.7 The COG prediction of intestinal flora in mice from each groupCOG:clusters of orthologous groups; C:control; M:model; L:low dosage; Z:medium dosage; H:high dosage.

2.5.2 KEGG功能預(yù)測(cè)

對(duì)照組和模型組中菌群功能的離散程度較大，且有個(gè)別較為突出，如對(duì)照組中二苯乙烯、二芳庚烯和姜辣素(stilbenoid, diarylheptanoid and gingerol)的生物合成，類黃酮(flavonoid)生物合成較模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，模型組中1,1,1-三氯-2,2-雙(4-氯苯基)乙烷(DDT)降解[1,1,1-Trichloro-2,2-bis(4-chlorophenyl)ethane (DDT) degradation ], β-半乳糖(betalain)生物合成, 吲哚生物堿(indole alkaloid)的生物合成的功能更顯著(P<0.05)。而石珍安神湯給藥組和喹硫平組對(duì)菌群功能的離散程度不大，在光合作用-觸角蛋白和鈣信號(hào)通路中與模型組差異較大(P<0.05)(圖8)。

3 討論

圖8 各組KEGG功能預(yù)測(cè)圖Fig.8 The KEGG prediction of intestinal flora in mice from each groupKEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes；C:control; M:model; L:low dosage; Z:medium dosage; H:high dosage; Q:quetiapine.

精神分裂癥對(duì)應(yīng)著中醫(yī)的“癲狂證”，大多由痰淤結(jié)于心間引起。精神分裂癥致病機(jī)制復(fù)雜，致病因素多變，導(dǎo)致精神分裂癥有多種中醫(yī)辨證分型。在本研究中筆者發(fā)現(xiàn)石珍安神湯可調(diào)節(jié)脫髓鞘模型小鼠的腸道菌群并在相關(guān)通路中有治療作用，說(shuō)明了SZAST在治療精神分裂癥時(shí)可能通過(guò)“微生物-腸-腦”軸發(fā)揮作用，并為抗精神病藥物的研制提供了新思路。

腸道菌群是腸道重要的組成部分，按比例和數(shù)量分布在腸道的不同位置且每個(gè)成年人擁有獨(dú)特的腸道微生物群組成。腸道菌群一般處于動(dòng)態(tài)平衡中，在調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)和代謝途徑中起著關(guān)鍵作用。如果腸道微生物群失衡則會(huì)導(dǎo)致一些生理疾病，例如胃腸道疾病、炎性腸病、肥胖和代謝疾病、癌癥、慢性肺病等[14]。還有研究[15]表明，腸道微生物群能夠通過(guò)“微生物群-腸道-大腦”軸來(lái)塑造大腦的生理甚至行為，是許多神經(jīng)精神疾病發(fā)展的關(guān)鍵觸發(fā)因素，導(dǎo)致類似精神疾病的生理和行為特征出現(xiàn)，例如自閉癥[9]、抑郁癥[16]等。也有研究[17]顯示，精神分裂癥患者血液中與微生物易位有關(guān)的血清學(xué)生物標(biāo)志物有所增加。事實(shí)上，微生物群與神經(jīng)元發(fā)育在童年和青少年時(shí)最活躍也是最脆弱的[18]，而精神分裂癥亦高發(fā)于青少年。

從結(jié)果看，石珍安神湯主要影響了變形菌綱、毛螺菌科和擬桿菌科。β-變形菌是革蘭陰性菌，是有害細(xì)菌。張雪等[19]發(fā)現(xiàn)在首發(fā)未用藥的精神分裂癥患者的糞便中變形桿菌是增高的。在本實(shí)驗(yàn)中筆者觀察到模型組的變形菌的豐度值升高，而給藥組可回調(diào)模型組升高的變形菌。伯克菌目是β-變形菌綱的一個(gè)目，在本實(shí)驗(yàn)中筆者觀察到模型組的伯克菌目的豐度值升高，而給藥組可降低模型組升高的伯克菌目。毛螺菌科是厚壁菌門梭菌目的革蘭弱陽(yáng)性細(xì)菌，是短鏈脂肪酸產(chǎn)生屬，為小鼠腸道內(nèi)重要的細(xì)菌群落。Bordoni等[20]的研究中發(fā)現(xiàn)帕金森動(dòng)物模型的毛螺菌科的豐度也有下降。短鏈脂肪酸產(chǎn)菌屬比例下降改變腸道通透性，從而改變腸道駐留者條件致病菌(主要是變形桿菌)進(jìn)入腸系膜淋巴或血液循環(huán)系統(tǒng)觸發(fā)周圍免疫炎性響應(yīng)[21]。在精神分裂癥患者的血液中觀察到有炎性因子的升高[22]，而在之前的脫髓鞘模型中證實(shí)了炎性反應(yīng)與脫髓鞘有關(guān)[23]。有研究[14]表明，擬桿菌門與陰性癥狀有關(guān)，有研究[24]顯示，在自閉癥兒童的糞便中有高豐度的擬桿菌。且細(xì)菌的高比例與抗結(jié)腸炎和低度全身炎性反應(yīng)有關(guān)[25]。本文研究結(jié)果表明，SZAST可回調(diào)減少的有益菌屬又可降低變形桿菌等有害菌屬的大量繁殖，說(shuō)明該復(fù)方可從調(diào)節(jié)腸道菌群方面治療精神分裂癥。且中藥復(fù)方具有多靶點(diǎn)整體調(diào)節(jié)的特點(diǎn)，在精神分裂癥的藥物治療中有著獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[26]。

綜上，筆者可得出腸道菌群失衡可能是脫髓鞘模型小鼠致病機(jī)制之一，石珍安神湯可通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群的多樣性而改善脫髓鞘模型小鼠的異常行為。白質(zhì)損害是精神分裂癥的致病機(jī)制之一，該中藥復(fù)方可改善脫髓鞘模型小鼠的腸道菌群和異常行為，為精神分裂癥的臨床用藥提供新思路。不過(guò)，精神分裂癥致病機(jī)制復(fù)雜，如今仍沒(méi)有公認(rèn)的疾病模型。另外機(jī)體腸道微生物的組成結(jié)構(gòu)復(fù)雜，腸道菌群與精神分裂癥之間的因果關(guān)系還需要進(jìn)一步研究。但本研究結(jié)果可能有助于理解精神分裂癥病因?qū)W中微生物組的作用，并有助于對(duì)精神分裂癥的微生物組進(jìn)行針對(duì)性干預(yù)。