楊龍艷 王 巖 許月超 程雅楠 馬 燕 趙 冬

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院內(nèi)分泌代謝與免疫性疾病中心 糖尿病防治研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 101149)

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是指除酒精和其他明確的肝損傷因素所致的肝細(xì)胞脂肪變性和脂質(zhì)貯積為特征的臨床病理綜合征。隨病程的進(jìn)展而表現(xiàn)為單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纖維化和肝硬化[1]。近年來NAFLD的發(fā)病率呈明顯的上升趨勢(shì)，一項(xiàng)Meta分析結(jié)果[2]顯示，全球NAFLD的發(fā)病率為25%，其中高達(dá)59%會(huì)進(jìn)展為脂肪性肝炎。NAFLD可直接導(dǎo)致失代償期肝硬化、肝細(xì)胞癌，還可參與2型糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病，嚴(yán)重危害人類健康[3]。目前對(duì)于NAFLD的診斷金標(biāo)準(zhǔn)是有創(chuàng)的肝組織活檢，對(duì)于無創(chuàng)的評(píng)估方法包括超聲、核磁共振等，都存在一定局限性。所以探索NAFLD的血清學(xué)標(biāo)志物至關(guān)重要。血管生成素樣蛋白4(angiopoietin-like 4，ANGPTL4)在肝臟、脂肪、巨噬細(xì)胞中合成，分泌入血后，抑制脂蛋白脂酶活性，參與脂代謝的調(diào)節(jié)[4]。本研究采用臨床病例對(duì)照研究，探討ANGPTL4與NAFLD及嚴(yán)重程度的關(guān)系，分析ANGPTL4作為NAFLD潛在的血清分子標(biāo)志物的可能性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年1月至12月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院內(nèi)分泌代謝與免疫性疾病中心診斷為NAFLD的52例患者為病例組(NAFLD組)，同期選取47例健康者為對(duì)照組。所有研究對(duì)象都由同一名超聲科醫(yī)生進(jìn)行腹部超聲檢查，并將NAFLD患者分為輕度、中度和重度。納入標(biāo)準(zhǔn)為：年齡30～50歲；不過量飲酒(男性：飲酒量<30 g/d，女性：飲酒量<20 g/d)。排除標(biāo)準(zhǔn)：糖尿病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(以下簡(jiǎn)稱冠心病)、腦血管病、慢性肝病、服用降脂藥或其他藥物的患者。

1.2 研究方法

(1)臨床檢測(cè)：測(cè)量身高、體質(zhì)量并計(jì)算體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)。檢查前，受試者從22∶00禁食，并在第二天早上7∶00～8∶00抽取靜脈血樣本。血液分析包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate amino transferase,AST)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-glutamyltransferase, GGT)、三酰甘油(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)。低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)。血清樣本分裝并儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱。

(2)ANGPTL4檢測(cè)：采用酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法檢測(cè)血清ANGPTL4濃度，人血清ANGPTL4的ELISA試劑盒購于日本Immuno-Biological Laboratories公司。

(3)NAFLD診斷：所有受試者都接受了腹部超聲檢查，由同一名超聲醫(yī)生進(jìn)行操作和實(shí)施。超聲檢查均采用HITACHI Preirus彩超診斷儀(日本日立公司)，探頭頻率1-5 MHz，觀察肝臟大小、形態(tài)、包膜、肝實(shí)質(zhì)回聲、肝內(nèi)血管結(jié)構(gòu)等。NAFLD超聲診斷分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：①輕度：肝實(shí)質(zhì)回聲彌漫性改變，稍細(xì)密、增強(qiáng)；后方回聲無衰減，包膜清晰；肝臟內(nèi)管狀結(jié)構(gòu)清晰可見。②中度：肝實(shí)質(zhì)回聲彌漫性改變，細(xì)密、增強(qiáng)；后方回聲有衰減，包膜欠清晰；肝臟內(nèi)管狀結(jié)構(gòu)欠清晰。③重度：肝實(shí)質(zhì)回聲彌漫性改變，顯著細(xì)密、增強(qiáng)；后方回聲衰減明顯，包膜不清或者不可見；肝臟內(nèi)管狀結(jié)構(gòu)不清或者不可見。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 2組基本特征比較

NAFLD組的年齡、BMI、收縮壓、舒張壓、ALT、AST和TC與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2組GGT、TG、HDL-C和LDL-C指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)，詳見表1。

2.2 各組間血清ANGPTL4濃度比較

為了分析ANGPTL4在NAFLD進(jìn)展中的作用，將52例NAFLD患者分為輕度NAFLD(28例)和中重度NAFLD (24例)。結(jié)果顯示，隨著NAFLD嚴(yán)重程度的升高，血清ANGPTL4濃度逐漸升高(F=4.553，P=0.0354)。提示ANGPTL4與NAFLD的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)，詳見表2。

2.3 ANGPTL4用于NAFLD評(píng)價(jià)的效果分析

ANGPTL4的ROC曲線下面積為0.638(95%CI：0.526～0.750)，表明ANGPTL4有一定識(shí)別NAFLD的能力。最大約登指數(shù)對(duì)應(yīng)的ANGPTL4濃度為90.93 ng/mL，以此作為診斷NAFLD的臨界值。診斷結(jié)果與超聲診斷結(jié)果的比較詳見表3。雖然診斷的靈敏度為100%，但特異度較低，一致性中等，可用于臨床的輔助診斷，但應(yīng)注意誤診率。

表1 NAFLD組與對(duì)照組基本特征比較

ItemNon-NAFLD(n=47)NAFLD(n=52)tPAge/a42.83±4.6637.52±4.485.700.000BMI/(kg·m-2)23.32±3.4027.69±3.33-8.000.000Systolic blood pressure/mmHg△115.9±15.6126.4±14.4-3.280.001Diastolic blood pressure/mmHg△70.35±9.7279.84±11.11-4.360.000ALT/(U·L-1)20.17±13.3541.79±31.03-4.780.000AST/(U·L-1)18.00±4.9723.38±11.85-3.080.003GGT/(U·L-1)27.65±31.3438.87±24.76-1.870.066TC/(mmol·L-1)1.17±0.702.40±1.33-5.680.000TG/(mmol·L-1)4.89±0.974.88±0.99-0.150.883HDL-C/(mmol·L-1)1.48±0.321.37±0.511.200.235LDL-C/(mmol·L-1)2.94±0.772.80±0.960.600.550

△1 mmHg=0.133 kPa;NAFLD: non-alcoholic fatty liver disease;BMI: body mass index;ALT:alanine aminotransferase;AST:aspartatea aminotransferase;GGT:γ-glutamyltransferase;TG:triglyceride;TC:total cholesterol;LDL-C: low density lipoprotein cholesterol;HDL-C: high density lipoprotein cholesterol.

表2 各組間血清ANGPTL4濃度比較

NAFLD: non-alcoholic fatty liver disease;ANGPTL4:angiopoietin-like 4.

表3 ANGPTL4用于NAFLD診斷的效果評(píng)價(jià)

Sensitivity=100%，Specificity=46.8%，Kappa=0.48;NAFLD:non-alcoholic fatty liver disease;ANGPTL4:angiopoietin-like 4.

3 討論

NAFLD是常見的一種慢性肝臟疾病，患病率逐年上升，目前已成為除病毒性乙型肝炎以外的又一嚴(yán)重影響肝臟功能的重大肝臟疾病。NAFLD患者多數(shù)沒有明顯的臨床癥狀和表現(xiàn)，多數(shù)因?yàn)轶w檢而被發(fā)現(xiàn)。NAFLD早期進(jìn)行干預(yù)或者治療是能夠逆轉(zhuǎn)的。NAFLD早期沒有及時(shí)發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行有效的干預(yù)治療，就會(huì)進(jìn)展為非酒精性脂肪性肝炎甚至是肝硬化、肝癌，所以NAFLD的早期診斷和治療至關(guān)重要。目前肝活檢仍是診斷NAFLD的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，肝活檢是一種侵入性的方法，而NAFLD發(fā)病率很高，用肝活檢來篩查NAFLD顯然是不可行的。各種血液標(biāo)志物檢測(cè)用于評(píng)估NAFLD的嚴(yán)重程度，目前纖維化試驗(yàn)，如BARD評(píng)分、NAFLD纖維化評(píng)分和Fibrosis-4指數(shù)，對(duì)晚期纖維化的診斷是有用，而不適于輕度NAFLD和非酒精性脂肪性肝炎(nonalco-hoic steatohepatitis, NASH)[5-8]。雖然在某些臨床情況下，NAFLD患者會(huì)出現(xiàn)血清ALT和AST的升高，但是這些肝酶指標(biāo)并不能特異性識(shí)別NAFLD并反映其嚴(yán)重程度。其他血清生物標(biāo)志物如細(xì)胞角蛋白18(cytokeratin 18,CK18)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)、白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑(interleukin-1 receptor antagonist, IL-1RA)、CXC趨化因子配體10[chemokine (C-X-C motif) ligand 10, CXCL10]、人纖溶酶原激活物抑制因子1(plasminogen activator inhibitor 1,PAI1)、脂肪因子和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(fibroblast growth factor 21, FGF21)被認(rèn)為可能作為NAFLD嚴(yán)重程度的非侵入性指標(biāo)，但都尚未被證明是臨床有效[9]。所以本研究探索NAFLD的血清學(xué)新的診斷標(biāo)志物，為NAFLD的早期診斷和區(qū)分嚴(yán)重程度提供新思路。

ANGPTL4屬于類血管生成素樣蛋白家族成員，分泌入血后，它被分解為N-末端片段(含有抑制脂蛋白酯酶活性區(qū)，可形成低聚物)和C-末端片段(含有纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)，保持單聚體狀態(tài))[10]。ANGPTL4通過抑制脂蛋白脂肪酶二聚體形成，而抑制脂蛋白脂肪酶的活性[11]。過表達(dá)ANGPTL4小鼠表現(xiàn)為高三酰甘油血癥；相反，在ANGPTL4敲除的小鼠，其三酰甘油下降65%～90%，極低密度脂蛋白膽固醇濃度下降，且伴有脂蛋白酯酶活性升高[12]。ANGPTL4在脂質(zhì)代謝中起到重要的作用。然而，血清ANGPTL4濃度與NAFLD之間的關(guān)系尚不清楚。

本研究結(jié)果提示，與非NAFLD對(duì)照相比，NAFLD患者血清ANGPTL4濃度明顯升高，并隨著NAFLD分級(jí)而升高(F=4.553，P=0.0354)。ANGPTL4的ROC曲線下面積為0.638，表明ANGPTL4有一定識(shí)別NAFLD的能力。血清ANGPTL4診斷結(jié)果與超聲診斷結(jié)果比較，靈敏度=100%，特異度=46.8%，Kappa=0.48。以上研究結(jié)果提示ANGPTL4在NAFLD的發(fā)生和進(jìn)展中起到重要作用，并對(duì)NAFLD的診斷具有一定的預(yù)測(cè)作用。以往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中研究[13]顯示腺病毒介導(dǎo)的ANGPTL4過表達(dá)可降低血糖并誘發(fā)C57小鼠的高脂血癥、肝腫大和脂肪肝。ANGPTL4增加了脂肪酸合成酶和硬脂酰輔酶A脫水解酶等幾種關(guān)鍵產(chǎn)脂酶的表達(dá)，使底物從糖異生轉(zhuǎn)為脂肪生成，進(jìn)而導(dǎo)致血糖濃度降低和肝臟TG含量增加[13]。鑒于ANGPTL4對(duì)糖代謝也有調(diào)控作用，所以本研究排除了糖尿病患者，單純研究ANGPTL4對(duì)NAFLD的作用。2019年5月的最新研究[14]顯示：地塞米松處理野生型小鼠顯著增加血漿三酰甘油濃度，而地塞米松處理ANGPTL4敲除小鼠，血漿三酰甘油濃度無明顯變化。說明ANGPTL4作為糖皮質(zhì)激素的靶基因，是長(zhǎng)期或者過量糖皮質(zhì)激素暴露導(dǎo)致脂質(zhì)紊亂包括高三酰甘油血癥和脂肪肝所必需的。以上動(dòng)物研究結(jié)果和本研究的結(jié)論一致，ANGPTL4在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。

綜上所述，NAFLD的早期診斷和及時(shí)干預(yù)治療可以逆轉(zhuǎn)早期NAFLD。所以探索NAFLD血清預(yù)測(cè)因子具有非常重要的意義，本研究顯示，與對(duì)照組相比，NAFLD患者血清ANGPTL4濃度升高，并隨著NAFLD的嚴(yán)重程度而逐漸升高。ANGPTL4對(duì)NAFLD患者具有一定的預(yù)測(cè)診斷能力。所以血清ANGPTL4濃度可能成為NAFLD以及嚴(yán)重程度的一個(gè)新的血清學(xué)預(yù)測(cè)指標(biāo)。