鄭曉敏 楊芳遠(yuǎn) 劉翠平 楊金奎

(1.清華大學(xué)附屬垂楊柳醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100022； 2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100730； 3.糖尿病防治研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730； 4.北京市糖尿病研究所,北京 100730)

糖尿病腎臟疾病(diabetic kidney disease, DKD)是重要的糖尿病微血管合并癥，是導(dǎo)致慢性腎功能受損的重要原因[1-2]，是糖尿病患者死亡的主要原因之一。DKD起病隱匿，進(jìn)入大量蛋白尿期后，其進(jìn)展到終末期腎病的速度大約是其他原因腎臟病的14倍。因此，DKD的早期診斷是預(yù)防糖尿病患者腎功能迅速進(jìn)展的基礎(chǔ)，在糖尿病患者中研究可以早期預(yù)測腎功能惡化的生物標(biāo)志物具有重要的臨床意義。尿液分析因其獲取簡便、收集無創(chuàng)和可提供大量腎臟生理變化發(fā)展進(jìn)程的信息，多年來一直是腎臟疾病研究的重點(diǎn)，近年來多項(xiàng)研究[3-4]顯示，尿觸珠蛋白(haptoglobin，Hp)可以作為糖尿病患者腎功能受損的早期標(biāo)志物，在早期DKD中可預(yù)測腎功能的進(jìn)展。由于尿液標(biāo)本成分復(fù)雜，影響因素眾多，尿Hp作為一種蛋白質(zhì)具有易降解及結(jié)構(gòu)變化等特點(diǎn)，其檢測容易受多種因素的影響，尿標(biāo)本的正確儲(chǔ)存是尿Hp檢測結(jié)果準(zhǔn)確的基礎(chǔ)。檢測結(jié)果的不可靠可能給臨床帶來錯(cuò)誤的信息，引起臨床的誤診和漏診。因此為避免長時(shí)間保存影響檢測結(jié)果，實(shí)驗(yàn)室常規(guī)流程中要求標(biāo)本采集后2 h內(nèi)送檢并完成檢測[5]。但臨床中常常會(huì)出現(xiàn)檢測延遲的狀況，延遲檢測時(shí)該如何保存尿液標(biāo)本才能盡量減少尿Hp濃度的變化，目前尚未見相關(guān)報(bào)道。本文將探討采用不同的標(biāo)本處理方法及不同保存溫度和時(shí)間的尿標(biāo)本Hp濃度的變化。

1 對象與方法

1.1 標(biāo)本收集

選取2019年7月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科住院診治的2型糖尿病患者40例，其中男性21例，女性19例，年齡34～87歲，平均年齡(60.50±12.98)歲，所有入選患者符合1999年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)糖尿病專家委員會(huì)提出的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]：“糖尿病癥狀(如多飲、多尿、多食、體質(zhì)量減輕)加上任意時(shí)間血糖≥11.1 mmol/L，或空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)≥7.0 mol/L，或口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(oral glucose tolerance test,OGTT)≥11.1 mmol/L”，若無臨床表現(xiàn)，需再測一次予以證實(shí)后確診。于早上8∶00留取晨起第二次尿標(biāo)本10 mL于15 mL離心管中，收集方法為自然排尿法，留取中段尿，應(yīng)避免經(jīng)血、白帶、精液、糞便等混入。

1.2 標(biāo)本處理

標(biāo)本收集后立即送至實(shí)驗(yàn)室，基礎(chǔ)值于收集后半小時(shí)內(nèi)檢測。樣本顛倒混勻5次后取2 mL分別置于兩個(gè)1.5 mL EP管中，其中一個(gè)EP管不經(jīng)離心，直接分為兩份，置于兩個(gè)EP管中，分別置于室溫(25 ℃)和冰箱冷藏(4 ℃)。另一個(gè)EP管600g離心5 min，取出上清液分別置于兩個(gè)EP管中，再分別置于室溫(25 ℃)和冰箱(4 ℃)冷藏。分別于放置3、6和24 h后檢測尿Hp濃度。每次檢測前確保樣本顛倒混勻5次。

1.3 Hp檢測

采用酶聯(lián)免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)(夾心法) 使用尿微量觸珠蛋白ELISA 檢測試劑盒(由石家莊和亞生物有限公司提供，4 ℃保存)檢測尿Hp濃度。檢測前樣本600g離心5 min。向預(yù)先包被了人Hp單克隆抗體的酶標(biāo)孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品及樣品10 μL/孔，震蕩混勻，37 ℃孵育60 min，洗去多余抗體后，加入與辣根過氧化物酶結(jié)合的人Hp單克隆抗體(HRP-Hp)100 μL/孔，37 ℃孵育30 min，洗去多余二抗后，加入酶特異性底物顯色劑100 μL/孔，震蕩混勻，置37 ℃避光顯色15 min，加入終止劑50 μL/孔，使用Thermo scientific Multiskan FC型酶標(biāo)儀以波長450 nm比色測定，標(biāo)準(zhǔn)曲線采用雙對數(shù)擬合，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算標(biāo)本Hp濃度。每板使用Hp質(zhì)控品(40 ng/mL)進(jìn)行質(zhì)控。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗(yàn)不符合正態(tài)分布，因此資料使用中位數(shù)(P25，P75)表示，組間中位數(shù)比較采用配對樣本的秩和檢驗(yàn)(Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn))。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 儲(chǔ)存時(shí)間對Hp檢測結(jié)果的影響

標(biāo)本不離心處理，室溫(25 ℃)放置3 h和6 h尿Hp濃度較基礎(chǔ)值無明顯變化(P>0.05)，室溫放置24 h，尿Hp濃度較基礎(chǔ)值明顯下降(P<0.01)。冷藏(4 ℃)儲(chǔ)存放置3 h較基礎(chǔ)值無明顯變化(P>0.05)，而放置6 h時(shí)尿Hp濃度明顯下降(P<0.01)。標(biāo)本經(jīng)600g離心5 min處理后室溫放置3 h尿Hp濃度較基礎(chǔ)值無明顯變化(P>0.05)，室溫放置6 h和24 h后，尿Hp濃度較基礎(chǔ)值明顯下降(P<0.01)。冷藏(4 ℃)儲(chǔ)存放置3 h較基礎(chǔ)無明顯變化(P>0.05)，而放置6 h時(shí)尿Hp濃度明顯下降(P<0.01),詳見表1。

2.2 離心對尿Hp檢測結(jié)果的影響

經(jīng)600g離心5 min的標(biāo)本于室溫儲(chǔ)存3 h和6 h后，其尿Hp檢測結(jié)果明顯低于未離心標(biāo)本(P<0.01)。而于冷藏儲(chǔ)存時(shí)，標(biāo)本放置3 h和6 h，離心標(biāo)本與未離心標(biāo)本結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見表2。

2.3 儲(chǔ)存溫度對尿Hp檢測結(jié)果的影響

未離心尿標(biāo)本放置3 h時(shí)，常溫與4 ℃相比,尿Hp檢測結(jié)果無顯著變化(P>0.05)，放置6 h時(shí)，4 ℃標(biāo)本的尿Hp檢測結(jié)果顯著低于常溫標(biāo)本(P<0.01)。經(jīng)600g離心5 min的標(biāo)本與未離心標(biāo)本結(jié)果相似，放置3 h時(shí)，常溫與4 ℃相比尿Hp檢測結(jié)果無顯著變化(P>0.05)，放置6 h時(shí)，4 ℃標(biāo)本的尿Hp檢測結(jié)果顯著低于常溫標(biāo)本(P<0.05),詳見表3。

表1 放置時(shí)間對尿標(biāo)本Hp濃度的影響

avs0 hour;bCentrifuge for 5 min at 600g;Hp:haptoglobin.

表2 離心對尿Hp檢測結(jié)果的影響

*Centrifuge for 5 min at 600g;Hp:haptoglobin.

表3 儲(chǔ)存溫度對尿Hp檢測結(jié)果的影響

*Centrifuge for 5 min at 600g;Hp:haptoglobin.

2.4 不同尿Hp濃度標(biāo)本放置不同時(shí)間和溫度對尿Hp分組的影響

根據(jù)尿Hp濃度將樣本分為3組：正常Hp組(Hp<20 ng/mL)、微量Hp組(Hp≥30 ng/mL～<200 ng/mL)和大量Hp組(Hp≥200 ng/mL)。表4統(tǒng)計(jì)了尿Hp濃度變化后引起當(dāng)前分組變化的標(biāo)本數(shù)量。正常Hp組標(biāo)本儲(chǔ)存24 h時(shí)比較穩(wěn)定，僅在6 h 常溫放置的不離心標(biāo)本和6 h 4 ℃放置的離心標(biāo)本中各有1例其檢測結(jié)果高于20 ng/mL，其余標(biāo)本的濃度變化均未改變當(dāng)前分組。微量Hp組放置3 h時(shí)各種方法的標(biāo)本變化均不大，僅1～3個(gè)標(biāo)本的變化引起分組變化，但放置6 h時(shí)，常溫放置的不離心和離心標(biāo)本分別有1個(gè)和3個(gè)標(biāo)本變化，而冷藏保存的標(biāo)本引起分組變化的標(biāo)本數(shù)量為7個(gè)和8個(gè)。大量Hp組的結(jié)果與微量Hp組結(jié)果相似，放置3 h時(shí)各種儲(chǔ)存條件均僅有0～2個(gè)標(biāo)本變化引起分組變化，放置6 h時(shí)變化最少的是不離心常溫放置,詳見表4。

表4 尿Hp濃度變化后引起分組變化的標(biāo)本數(shù)量

3 討論

DKD是糖尿病的常見微血管合并癥，是我國慢性腎臟病的重要病因，也是導(dǎo)致終末期腎臟病的主要病因，給糖尿病患者帶來高致殘率及致死率。約20%～40%的DM患者最終發(fā)展為DKD[7]。DKD若能早期診斷，強(qiáng)化降糖和降壓治療及腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)抑制劑的治療可以延緩腎臟功能惡化的進(jìn)展速度。研究[8]證明，目前常規(guī)使用的尿微量白蛋白對診斷2型糖尿病腎病的特異性不足，對預(yù)測病情的轉(zhuǎn)歸也存在局限性。近年來多項(xiàng)研究[3-4]顯示,尿Hp可以作為糖尿病患者腎功能受損早期診斷的生物標(biāo)志物，它在早期DKD中可以預(yù)測腎功能的進(jìn)展。

Hp是一種炎性反應(yīng)的急性期反應(yīng)蛋白，是人體內(nèi)血清α2球蛋白成分的一種，其廣泛分布于血液和其他體液中，其合成的主要部位為肝臟[9]。Hp主要的生理功能是與血液中的游離血紅蛋白(hemoglobin，Hb)結(jié)合并被清除，阻止游離Hb進(jìn)一步發(fā)生氧化還原反應(yīng)導(dǎo)致相應(yīng)的組織損傷[10]。糖尿病患者血中Hp的濃度較無糖尿病患者增高， DKD早期腎小球?yàn)V過屏障發(fā)生病理異常，導(dǎo)致腎小球?yàn)V過屏障不穩(wěn)定，可允許Hp及Hb-Hp復(fù)合物通過濾過屏障[11-12]。可出現(xiàn)尿中Hp增高。另外，近年來有研究[13]顯示，腎臟近曲小管的上皮細(xì)胞在某些病理情況下可以合成和分泌Hp，導(dǎo)致尿中Hp增高。

雖然目前已有多項(xiàng)研究[3-4]證實(shí)尿Hp濃度對DKD的早期診斷的臨床意義，但由于尿液標(biāo)本成分復(fù)雜，影響因素眾多，因此為避免長時(shí)間保存影響檢測結(jié)果，常規(guī)關(guān)于尿液檢驗(yàn)要求盡可能留尿后2 h內(nèi)完成檢測。但由于臨床條件所限，常常會(huì)有檢測延遲的情況，當(dāng)不能滿足2 h內(nèi)檢測的要求時(shí)，轉(zhuǎn)運(yùn)過程中是否需要冷藏保存，標(biāo)本中Hp可以保持穩(wěn)定多長時(shí)間，是尿Hp作為DKD標(biāo)志物廣泛應(yīng)用于臨床前亟待解決的問題。本研究結(jié)果顯示,標(biāo)本不離心處理，室溫放置3 h和6 h尿Hp濃度無明顯變化，室溫放置24 h，尿Hp濃度明顯下降，冷藏放置3 h，尿Hp濃度無明顯變化，而放置6 h時(shí)尿Hp濃度明顯下降。離心處理后的標(biāo)本室溫和冷藏放置3 h尿Hp濃度無明顯變化，室溫和冷藏放置6 h及室溫放置24 h，尿Hp濃度均明顯下降。因此若尿標(biāo)本可在3 h內(nèi)檢測，不論何種處理方式或者儲(chǔ)存方式均可保證尿hp濃度的穩(wěn)定。室溫放置6 h的未離心標(biāo)本可保持尿Hp濃度穩(wěn)定。冷藏及離心可導(dǎo)致尿Hp濃度的降低。

另外，尿Hp濃度變化帶來的臨床意義與尿Hp基礎(chǔ)濃度相關(guān)。因?yàn)槟騂p的臨床意義主要是其濃度升高提示糖尿病患者的腎臟受損，因此對于低濃度的尿Hp患者其Hp濃度進(jìn)一步降低并不會(huì)導(dǎo)致對臨床結(jié)果判定的改變，而高濃度的基礎(chǔ)尿Hp標(biāo)本若出現(xiàn)其濃度下降，將導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，或者將大量Hp的患者判定為微量Hp患者。本研究結(jié)果證實(shí)對于尿Hp濃度正常的患者，其尿液標(biāo)本放置24 h內(nèi)檢測較少導(dǎo)致臨床意義的改變，而對于尿中含有微量和大量Hp的患者，尿Hp濃度的延遲檢測可能導(dǎo)致結(jié)果的誤判。在常溫放置6 h內(nèi)較少發(fā)生誤判，但冷藏放置6 h可導(dǎo)致約半數(shù)的誤判。多數(shù)標(biāo)本主要表現(xiàn)為尿Hp濃度的降低，導(dǎo)致疾病的漏診。因此認(rèn)為當(dāng)延遲檢測不可避免時(shí)建議常溫放置不超過6 h，無需冷藏放置。

目前尚未見關(guān)于尿Hp保存條件的相關(guān)報(bào)道，但不同溫度條件下，各種尿液其他檢測指標(biāo)的穩(wěn)定性有相關(guān)報(bào)道。尿中肌酐的穩(wěn)定性較好，在4 ℃或25 ℃將標(biāo)本放置30 d，尿中肌酐濃度仍能保持穩(wěn)定[14]。而尿糖在冷藏(4 ℃)條件下僅能穩(wěn)定24 h[15]。室溫或是冷藏條件下尿液標(biāo)本不適宜存放超過24 h。若需長時(shí)間保存尿液標(biāo)本需進(jìn)行低溫凍存。在-20 ℃冰凍狀態(tài)下，尿肌酐濃度在6個(gè)月內(nèi)可保持穩(wěn)定[16]。由于微量白蛋白尿?qū)δI臟疾病的診斷作用，目前關(guān)于尿微量白蛋白儲(chǔ)存條件的研究引起廣泛關(guān)注[17-18]。儲(chǔ)存后的尿標(biāo)本的微量白蛋白檢測結(jié)果的影響因素包括儲(chǔ)存時(shí)間、儲(chǔ)存溫度、儲(chǔ)存容器、白蛋白濃度、標(biāo)本pH值、檢測方法等。尿白蛋白濃度在室溫下可放置1～3 d 保持濃度穩(wěn)定，冷藏可放置保存3～7 d穩(wěn)定[19]。含有防腐劑的尿液標(biāo)本白蛋白/肌酐比率在4 ℃ 和18 ℃穩(wěn)定7 d，在30 ℃穩(wěn)定2 d。含防腐劑的樣本在3個(gè)凍融循環(huán)后及-80 ℃冷凍存儲(chǔ)6個(gè)月均穩(wěn)定[20]。

本研究結(jié)果中提示,低溫和離心后長時(shí)間放置可導(dǎo)致尿Hp濃度的下降，其原因考慮可能為：1)人類尿液樣本中存在尿蛋白酶，可以降解儲(chǔ)存的尿液中的各種蛋白質(zhì)，并且在低pH條件下尿蛋白酶的活性會(huì)增加[21]，尿中酶類物質(zhì)分解Hp導(dǎo)致尿標(biāo)本中Hp降解，因此尿Hp濃度下降；2)低溫后尿中磷酸鹽、尿酸鹽、草酸鹽等可溶性結(jié)晶析出，析出的結(jié)晶與Hp結(jié)合形成復(fù)合物后沉淀析出，導(dǎo)致可溶性尿Hp濃度減低；3)尿中Hp可能與其他物質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物沉淀，如高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、某些炎性反應(yīng)介質(zhì)等[22]；4)尿pH值較血pH值低，可能導(dǎo)致尿Hp的析出；5)低溫可能導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)變化、部分沉淀、抗體結(jié)合位點(diǎn)丟失或者吸附到管壁；6)本研究中采用ELISA夾心法檢測，Hp與單克隆抗體反應(yīng)后形成的免疫復(fù)合物，尿液中結(jié)晶等雜質(zhì)可能影響抗原抗體的結(jié)合，影響尿Hp濃度的檢測。

本研究由于標(biāo)本量較小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果尚需進(jìn)一步大樣本研究來證實(shí)。但本研究提示,針對可以提示DKD的指標(biāo)——尿Hp濃度的檢測，若6 h內(nèi)可完成檢測推薦常溫儲(chǔ)存，不適當(dāng)?shù)姆磸?fù)溫度的變化反而會(huì)影響尿Hp濃度的檢測。