曹 靜 汪萌芽

睡眠剝奪(sleep deprivation，SD)是指各種因素所致的睡眠減少和睡眠時間嚴重不足，是由于自身生理、病理因素或環(huán)境的影響而影響了生理所需睡眠量的狀態(tài)[1]。研究[2]顯示，SD后人們出現(xiàn)學習記憶能力下降現(xiàn)象。梔子苷(geniposide)是從梔子的干燥成熟果實中提取制成的環(huán)烯醚萜苷類化合物，是梔子中發(fā)揮藥效作用的主要成分[3]。有研究[4]表明，梔子苷能改善生物睡眠。但有關梔子苷對生物行為和認知影響的研究鮮有報道。為此，本研究通過建立SD大鼠模型，并給予不同劑量梔子苷干預，以期了解梔子苷對SD大鼠學習記憶的影響，為臨床SD患者學習記憶的改善提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇SPF級雄性Sprague -Dawley大鼠50只，購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場,動物許可證號：SCXK(蘇)2017-0001]，體質(zhì)量200～250 g，10周齡。所有大鼠飼養(yǎng)條件一致：籠養(yǎng)，每天接受光照12 h,黑暗12 h，光照周期為8:00～20:00。實驗溫度為(20±2)℃，濕度60%，喂以大鼠標準飼料和清潔飲用水，大鼠可自由攝食、攝水。動物實驗遵守國際實驗動物倫理學要求。

1.2 設備與藥品 Morris水迷宮水池由本實驗室參照文獻[5]自制；一個自制的不銹鋼可視平臺, 一個采用亞克力材料自制的透明不可視平臺。兩個平臺均為直徑10 cm、高30 cm的圓柱體。梔子苷原料藥(合肥拜爾迪化學科技有限公司，分析標準品≥98%)。

1.3 動物分組、造模與鑒定 將大鼠適應性喂養(yǎng)一周之后稱重，在體質(zhì)量無差別情況下，利用隨機數(shù)字表法分為5組：正常組10只，正常飼養(yǎng)不加任何處理；SD組10只，建立SD模型；梔子苷低劑量組10只，建立SD模型并給予低劑量梔子苷(10 mg/kg)干預；梔子苷中劑量組10只，建立SD模型并給予中劑量梔子苷(20 mg/kg)干預；梔子苷高劑量組10只，建立SD模型并給予高劑量梔子苷(40 mg/kg)干預。除正常組以外，對其他4組大鼠采用輕觸+換籠方法[6]建立SD模型：即每天剝奪大鼠睡眠8 h(上午9點-下午5點)，連續(xù)7天，期間每小時換籠1次，每天換籠9次。在此期間，當大鼠出現(xiàn)點頭、協(xié)靠、依靠或者打盹等現(xiàn)象時，給予大鼠刺激，用報紙輕輕拍打籠子，但要注意避免與大鼠直接接觸。連續(xù)7天后按文獻[7]進行SD模型驗證:大鼠全身皮毛疏松，毛發(fā)發(fā)黃無光澤，并逐漸出現(xiàn)活動明顯減少，打盹次數(shù)增多，對刺激敏感性降低，眼色暗紅，激惹呈回避反應等，甚至同性騎行行為。按余群星[8]報道的方法對5組大鼠進行尋找平臺訓練，結果剔除了不符合實驗條件的大鼠4只，即正常組和梔子苷低、中、高劑量組各一只。

1.4 給藥方法 用藥方法按照武海霞等[9]的研究進行，正常組、SD組分別予以灌胃蒸餾水(0.01 mL/kg)，梔子苷低劑量組灌胃梔子苷稀釋溶液0.01 mg/mL，中劑量組為0.02 mg/mL，高劑量組為0.04 mg/mL，灌胃劑量均為0.01 mL/g。

1.5 觀察指標 梔子苷干預一周后，采用Morris 水迷宮測試5組大鼠第1天至第7天逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)及第一次到達原平臺時間。

1.5.1 水迷宮建立 參照文獻[5]自制Morris水迷宮水池，即直徑120 cm高 50 cm的不銹鋼圓形水池, 十字均分為4個虛擬象限，2個平臺可置于同一任意一個象限中央。

1.5.2 逃避潛伏期檢測 按余群星[8]報道的方法進行逃避潛伏期檢測。將5組大鼠從4個象限的任一象限面向池壁放入水中，每個象限測試一次，若大鼠能找到并登上平臺，在平臺上停留5 s后則停止記錄，記錄的大鼠找到平臺在水中消耗的時間記為逃避潛伏期；若大鼠60 s內(nèi)未找到平臺，則停止計時后由實驗者引導其登上平臺并停留15 s，此時的逃避潛伏期計為60 s。連續(xù)檢測7天。逃避潛伏期長表示大鼠學習能力降低。

1.5.3 穿越平臺次數(shù)及第一次到達原平臺時間檢測 連續(xù)7天逃避潛伏期檢測結束1 h后, 撤掉平臺,將大鼠從原平臺所在象限的對側象限放入水中，檢測大鼠在60 s內(nèi)穿過原平臺所在位置的次數(shù)(穿越原平臺次數(shù))及第一次到達原平臺的時間。穿越原平臺次數(shù)少及第一次到達原平臺的時間長表示大鼠的記憶能力降低。

2 結果

2.1 5組大鼠逃避潛伏期比較 梔子苷干預一周后，5組大鼠第一天至第7天的逃避潛伏期比較，不同時間、組間、組間及時間的交互效應差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。因本重復測量資料不滿足球形度檢驗，故采用Greenhouse-Geisser進行檢驗。與正常組大鼠比較，SD組大鼠第一天到第7天逃避潛伏期明顯延長，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與SD組比較，梔子苷低、中、高劑量組逃避潛伏期縮短，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。梔子苷低劑量組逃避潛伏期長于梔子苷中、高劑量組，梔子苷中劑量組逃避潛伏期長于梔子苷高劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 5組大鼠第一天至第7天逃避潛伏期比較

注：同一時間不同組間的比較，符號(a，b，c，d)完全不同表示P<0.05;與第1天比較，*P<0.05;與第2天比較，P<0.05;與第3天比較，P<0.05;與第4天比較，P<0.05;與第5天比較，P<0.05

2.2 5組大鼠穿越平臺次數(shù)及第一次到達原平臺時間的比較 5組穿越平臺次數(shù)、第1次抵達原平臺時間的組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與正常組比較，SD組大鼠穿越原平臺次數(shù)均明顯減少，第1次抵達原平臺時間均明顯延長，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與SD組比較，梔子苷低、中、高劑量組大鼠穿越平臺次數(shù)均明顯增多，第1次抵達平臺時間明顯縮短，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與梔子苷低劑量組比較，梔子苷中、高劑量組穿越平臺次數(shù)增多，第一次到達原平臺時間延長；梔子苷中劑量組穿越平臺次數(shù)少于梔子苷高劑量組，第一次到達原平臺時間長于梔子苷高劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 5組大鼠穿越平臺次數(shù)及第一次到達原平臺時間比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與SD組比較，#P<0.05；與梔子苷低劑量組比較，P<0.05；與梔子苷中劑量組比較，P<0.05

3 討論

睡眠是人類維持正常生命不可或缺的生理活動，一旦發(fā)生SD，則會導致機體發(fā)生一系列改變，包括生理、心理以及病理、行為學異常等[10]。目前對于SD的治療，多采用鎮(zhèn)靜、催眠作用的精神類藥物，長期服用此類藥物可導致耐藥性，最終影響神經(jīng)系統(tǒng)功能[11]。而中藥制劑毒性作用低且能標本兼治，既不會成癮，也不會產(chǎn)生依賴性[12]。梔子苷是從梔子的干燥成熟果實中提取，其主要成分為環(huán)烯醚萜類化合物。梔子苷能改善生物睡眠[4]，藥理學研究[13-15]表明，梔子苷具有抗老年癡呆功效，可明顯改善學習記憶功能。本研究探討梔子苷對SD大鼠學習記憶的影響，以期為臨床對抗SD人群學習記憶能力下降提供藥物治療依據(jù)。

有研究[16]顯示，10周齡雄性SD大鼠的學習記憶能力相對穩(wěn)定，故本研究選擇此類型大鼠為實驗對象。本組資料顯示，SD組大鼠第1天至第7天的逃避潛伏期長于正常組，SD組大鼠穿越平臺次數(shù)少于正常組、第1次抵達原平臺時間長于正常組(P均<0.05)，表明SD大鼠存在學習記憶力下降。此與甘麗[17]的研究結果一致，這可能是與一氧化氮合酶在前額和海馬中的神經(jīng)元表達水平下降有關。具有神經(jīng)毒性的一氧化氮合酶在SD后濃度增加，使得應激強度過大，導致神經(jīng)元損傷[18]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，與SD組比較，梔子苷低、中、高劑量組大鼠逃避潛伏期縮短(P<0.05)。梔子苷低劑量組大鼠逃避潛伏期長于梔子苷中、高劑量組(P<0.05)，說明對SD大鼠進行梔子苷干預后，大鼠學習能力得到了一定程度的改善。與SD組比較，梔子苷低、中、高劑量組大鼠穿越平臺次數(shù)均增多(P<0.05)，第一次抵達平臺時間縮短(P<0.05)，且梔子苷劑量越高，大鼠穿越平臺次數(shù)越多及第一次抵達平臺時間越短，表明梔子苷干預劑量對SD大鼠記憶能力的改善有影響，劑量相對較高時改善效果更好。此與陳安春等[19]的研究結果較為一致。這可能是SD后可引起大鼠代謝增加、自主神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂等, 而生物體內(nèi)一些重要神經(jīng)遞質(zhì)如一氧化氮、多巴胺、5-羥色胺、乙酰膽堿、自由基等的改變, 都與學習記憶密切相關[18]。因此SD后學習記憶能力下降可能與SD后腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的改變有關。梔子苷能降低氧化應激傷害，增加腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的釋放[20]，起到神經(jīng)保護作用，從而改善學習記憶[21]。

綜上所述，梔子苷能改善SD大鼠的學習記憶能力，且高劑量組梔子苷可以明顯縮短逃避潛伏期和大鼠尋找平臺的時間，同時也增加SD大鼠的探究行為。由于本研究只進行了行為學觀察，其具體機制有待今后進一步深入研究。