張河慶，韓 帥，吳 婕，席亞東，李洪浩

(四川省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所/蔬菜種質(zhì)與品種創(chuàng)新四川重點實驗室，四川 成都 610066)

黃瓜枯萎病是一種主要由尖孢鐮刀菌黃瓜專化型(Fusariumoxysporum.sp.cucumebrium Owen)侵染引起的病害，通常會造成10%～30%的減產(chǎn)損失，重病田塊減產(chǎn)高損失達80%～90%，甚至絕收[1]。目前黃瓜枯萎病常用的防治措施有選用抗病品種、嫁接、化學藥劑防治、生物菌劑防治等。選用抗病品種是防治黃瓜枯萎病最經(jīng)濟有效的措施，但是由于傳統(tǒng)育種周期長，黃瓜枯萎病抗源材料不足，培育出的抗枯萎病品種有限，生產(chǎn)中使用的品種仍然以感病品種為主[2]。嫁接能夠克服黃瓜枯萎病引起的連作障礙，但嫁接后果實品質(zhì)會受到一定影響。噁霉靈、咯菌腈、威百畝等化學藥劑能在一定程度上防治黃瓜枯萎病[3-4]，但長期大量使用化學藥劑會造成水源和土壤污染，為害人類健康。

生物菌劑防治黃瓜枯萎病是目前研究的重點。生物菌劑防治主要利用微生物的拮抗作用及其代謝產(chǎn)物對病原菌的抑制作用，來降低枯萎病的發(fā)生。研究較多的微生物有木霉菌屬、芽孢桿菌屬、放線菌屬。其中，哈茨木霉菌對黃瓜枯萎病抑制效果比較明顯，且已經(jīng)商品化。如美國的哈茨木霉菌T22、以色列的哈茨木霉菌T39、在國內(nèi)取得登記證的木霉菌制劑有16個。Thangavelu等報道哈茨木霉菌Th210能夠很好地抑制香蕉枯萎病病原菌的生長[5]。黃新琦報道使用含哈茨木霉菌的生物有機肥能夠有效控制黃瓜枯萎病的發(fā)生[6]。研究表明，哈茨木霉菌能夠誘導黃瓜WRKY6、MYB 等抗性基因的表達，提高防御黃瓜枯萎病酶的活性，增強黃瓜對枯萎病的抵抗力[7]。

本文為研究木霉菌T2562對黃瓜枯萎病和豇豆根腐病的防治效果，開展了平板對峙試驗和盆栽防治試驗，為木霉菌T2562在黃瓜生產(chǎn)中防治枯萎病提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黃瓜枯萎病病原菌(Fusariumoxysporum.sp.cucumebrium Owen)(購買于中國微生物保藏中心菌種編號ACC39326)，豇豆根腐病病原菌(Fusarium solani)(本實驗室分離保存)，木霉菌T2562(由哈茨木霉菌與鉤狀木霉菌原生質(zhì)體融合改良獲得)，供試黃瓜品種為二早子。

1.2 平板對峙試驗

將木霉菌T2562與病原菌對峙接種在PDA平板上，兩接菌點相距4cm，菌塊直徑0.5cm。同時，單獨接種黃瓜枯萎病病原菌做對照。設(shè)3次重復，在25℃恒溫下培養(yǎng)，當對照病原菌菌落半徑為2～4cm時，測量對照組病原菌菌落半徑(R1)和對峙組病原菌菌落中心到木霉菌菌落邊緣的距離(R2)，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)，并計算木霉菌T2562對病原菌菌絲的生長抑制率(I)。I(%)=100*((R1-R2)/R1)。

1.3 盆栽防治試驗

制備接種用黃瓜枯萎病病原菌孢子懸浮液，用打孔器取在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基上培養(yǎng)5d的黃瓜枯萎病原菌，接種于裝有300mL馬鈴薯葡萄糖(PD)液體培養(yǎng)基中，置于25℃，180rpm搖床上培養(yǎng)5d，過濾收集黃瓜枯萎病菌分生孢子，并稀釋成濃度為1×106個/mL的病原菌孢子懸浮液。用浸根方法接種黃瓜幼苗，將一片子葉的黃幼苗浸泡與病原菌孢子懸浮液30min，然后移栽于營養(yǎng)缽中，同時接種木霉菌T2562分生孢子懸浮液，不同處理濃度分別為TA:1×109個/mL、TB:1×108個/mL、TC:1×107個/mL和TD：1×106個/mL，接種量為每棵10mL。接種10mL清水的作為對照(CK)。每個處理50株，試驗重復3次。處理后的黃瓜幼苗在玻璃溫室中培養(yǎng)，試驗期間白天溫度控制在25℃左右，夜晚溫度控制在16℃左右。當對照組充分發(fā)病后，調(diào)查各個處理的發(fā)病率，計算防治效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 平板對峙試驗效果

由平板對峙試驗結(jié)果可知(表1)，72h對照組黃瓜枯萎病原菌菌落半徑R1為2.23±0.02cm，對峙組黃瓜枯萎病原菌菌落R2為0.87±0.03cm；此時木霉菌對黃瓜枯萎病菌菌絲的生長抑制率為61.18%±1.35%，且木霉菌T2562長滿皿內(nèi)。96h對照組黃瓜枯萎病原菌菌落半徑R1為2.97±0.03cm，對峙組黃瓜枯萎病原菌菌落R2仍為0.87±0.03cm，此時木霉菌對黃瓜枯萎病菌菌絲的生長抑制率為70.77%±1.08%，且木霉菌菌絲完全覆蓋枯萎病菌菌落。5d后(120h)木霉菌T2562完全覆蓋黃瓜枯萎病原菌菌落并產(chǎn)生分生孢子對黃瓜枯萎病菌菌絲生長抑制率為79.62%±0.79%。黃瓜枯萎病原菌菌落萎縮(R2=0.73±0.03cm)，菌落顏色變暗，菌落背面為橘黃色。木霉菌T2562對豇豆根腐病原菌菌絲生長抑制率僅為59.31%±1.27%，且不能完全覆蓋豇豆根腐病原菌菌落。

表1 木霉菌對黃瓜枯萎病病原菌菌絲生長抑制效果

2.2 木霉菌T2562對黃瓜枯萎病的盆栽防治效果

接種20d后對照組黃瓜枯萎病充分發(fā)病，發(fā)病率為82.67%±2.91%。木霉菌T2562濃度為1×108個/mL(TB)時對黃瓜枯萎病的防治效果最好(64.52%±4.31%)，濃度為1×109個/mL (TA)時的次之(62.05%±4.28%)，濃度為1×106個/mL(TD)時的最差(57.07%±8.86%)；但各處理間對黃瓜枯萎病的防治效果無顯著差異。木霉菌T2562各處理(TA、TB、TC、TD)的黃瓜枯萎病發(fā)病率顯著低于對照(CK)的，但各處理間無顯著差異。

注：圖中TA：T2562分生孢子濃度1×109個/mL；TB： T2562分生孢子濃度1×108個/mL；TC: T2562分生孢子濃度1×107個/mL；TD: T2562分生孢子濃度1×106個/mL。*表示在P<0.05水平上差異顯著。

3 討論

在平板內(nèi)木霉菌T2562對黃瓜枯萎病病原菌生長抑制率達到了79.62%±0.79%，而在盆栽試驗中對黃瓜枯萎病的防治效果最高為64.52%±4.31%，防治效果低于平板內(nèi)的抑制效果，且隨著木霉菌分生孢子濃度的增加并不能顯著提高對黃瓜枯萎的防治效果。這可能是因為在平板內(nèi)木霉菌的生長速度快，對病原菌菌絲的抑制能力強；而盆栽試驗中，在木霉-黃瓜枯萎病菌-黃瓜相互作用下，木霉菌的生長速度優(yōu)勢不一定能完全體現(xiàn)出來。木霉菌株對黃瓜枯萎病菌的拮抗作用并不一定與盆栽試驗防治效果呈正相關(guān)。有研究表明，一些木霉菌在平板內(nèi)抑菌效果好，但在盆栽試驗中防治效果差，如朱萍萍等的研究中，平板拮抗試驗有13株木霉菌對黃瓜枯萎病菌抑制效果達75%以上，而在盆栽試驗中僅有2株木霉菌的防治效果達到60%以上,其他木霉菌株的防效均在40%以下[8]。而張春秋等人研究結(jié)果表明，平板對峙試驗中棘孢木霉525對黃瓜枯萎病菌的抑制率達為80.24%，同時盆栽試驗中對黃瓜枯萎病的防治效果到達了81.53%，與平板對峙試驗中的結(jié)果有較好的一致性[9]。因此，平板對峙試驗抑菌效果好的木霉菌還需盆栽試驗和田間試驗進一步驗證。木霉菌T2562與豇豆根腐病菌對峙結(jié)果表明，木霉菌T2562對豇豆根腐病菌菌絲生長抑制率較低，僅為59.31%±1.27%(見表1)，雖然黃瓜枯萎病和豇豆根腐病的病原菌均屬于鐮刀菌屬，但屬于不同種類，木霉菌T262對其抑制效果也不相同。針對豇豆根腐病還需要篩選防治效果更好的生防菌劑。

本研究探索了改良木霉菌T2562在防治黃瓜枯萎病和豇豆根腐病上的潛力。木霉菌T2562對黃瓜枯萎病防治具有較好的田間應(yīng)用前景，盆栽試驗中對黃瓜枯萎病的防治效果達到了60%以上。為實現(xiàn)黃瓜枯萎病的科學合理防治, 減少化學農(nóng)藥的使用提供依據(jù)。