孫麗平，齊海艷，鄭洪偉，杜研，楊春娟，甘春麗

(1.哈爾濱醫(yī)科大學藥學院藥物化學與天然藥物化學教研室，哈爾濱 150081；2.沈陽藥科大學中藥學院，沈陽 110016；3.中國水利水電科學研究院，北京 100038)

紫錐菊[Echinaceapurpurea(L.) Moench]為菊科松果菊屬多年生草本植物，共有8個種和數(shù)個變種，藥用者主要為紫錐菊[E.purpurea(L.) Moench]、狹葉紫錐菊[Echinaceaangustifolia(DC.) Hell]和白紫錐菊[Echinaceapallia(Nutt.) Nutt]，已開發(fā)為藥物主要為前兩種。研究表明，紫錐菊具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎及抗病毒等活性，其提取物在我國保健品和藥品市場有巨大的發(fā)展?jié)摿1-3]。紫錐菊中含有多種化學成分，如酚酸類、多糖、烷基酰胺類、倍半萜類、揮發(fā)油、生物堿類和多炔類等。主要活性成分酚酸含量較高，是《美國藥典》(USP35)用于評價藥材的指標性成分[4-5]。目前，我國多個地區(qū)引進紫錐菊，并且栽培成功，但有關(guān)藥材質(zhì)量評價和商用提取物標準的研究各異，藥材質(zhì)量存在較大差異[6-10]。筆者在本實驗采用高效液相色譜(HPLC)法對15個產(chǎn)地紫錐菊提取物中7種酚酸類成分的含量進行測定，同時采用層次聚類分析法對紫錐菊提取物中酚酸成分進行分類歸納，為制定引種紫錐菊及其提取物質(zhì)量標準提供參考[11-13]。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1260色譜儀(美國安捷倫公司)，Agilent 1260型二級陣列管檢測器(美國安捷倫公司)，HHS型電熱恒溫水浴鍋(博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，KQ3200E超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，BP210S電子天平(德國Satorius公司，感量：0.1 mg)。

1.2主要試藥 紫錐菊藥材購于陜西、河北、湖北、湖南等15個產(chǎn)地，經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學藥學院生藥教研室鑒定為菊科松果菊屬植物紫錐菊[Echinaceapurpurea(L.) Moench]。對照品：3，4-二羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、菊苣酸、香草酸、4-羥基苯甲酸均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，含量均大于98.0%。無水乙醇、磷酸(分析純，天力化學有限公司)，甲醇(色譜純，百靈威科技有限公司)，純凈水(娃哈哈集團有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：Inertsil C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，流速：0.8 mL·min-1，檢測波長：280 nm，柱溫：30 ℃，進樣量：10 μL，流動相：A為0.1%磷酸水溶液，B為甲醇；梯度洗脫：0～10 min，10%→20% B；>10～40 min 20% B；>40～45 min，20%→23% B；>45～50 min，2 3%→34% B；>50～63 min，34%→35% B；>63～0 min 35%→40% B；>70～75 min，40% B。在上述色譜條件下，各組分理論板數(shù)均不低于3000，樣品中各待測組分與相鄰峰分離度均大于1.5。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備 精密稱取下列對照品：3，4-二羥基苯甲酸(1)、綠原酸(2)、咖啡酸(3)、丁香酸(4)、對香豆酸(5)、阿魏酸(6)、菊苣酸(7)適量，分別用甲醇溶解并稀釋成2.083，2.086，2.124，2.102，2.068，2.121，1.963 mg·mL-1的混合對照品貯備液。

2.2.2供試品溶液的制備 精密稱取紫錐菊藥材粉末10 g，乙醇體積分數(shù)40%，料液比1：20，50 ℃加熱提取2次，每次提取2.5 h。合并提取液，濾過，減壓濃縮至干，加適量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇定容搖勻，進樣前用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3專屬性實驗 取3，4-二羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、菊苣酸的混合對照品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下，進樣測定，各組分理論塔板數(shù)均不低于3000，樣品中各待測組分與相鄰峰分離度均大于1.5，該方法專屬性良好，色譜圖見圖1。

A.對照品溶液；B.紫錐菊提取物供試品溶液；1.3，4-二羥基苯甲酸；2.綠原酸；3.咖啡酸；4.丁香酸；5.對香豆酸；6.阿魏酸；7.菊苣酸。

圖1 紫錐菊提取物中7種酚酸類成分HPLC色譜圖

A.reference solution；B.Echinaceapurpurea extract test solution；1.3，4-dihydroxybenzoic acid；2.Chlorogenic acid；3.Caffeic acid；4.Eugenic acid；5.P-coumaric acid；6.Ferulic acid；7.Cichoric acid.

Fig.1 HPLC chromatogram of seven phenolic acids inEchinaceapurpurea extract

2.4標準曲線和線性范圍 精密吸取各對照品溶液適量，置于量瓶中，用甲醇逐級稀釋成3，4-二羥基苯甲酸為1.627～104.2 μg·mL-1、綠原酸為5.704～365.1 μg·mL-1、咖啡酸為3.319～212.4 μg·mL-1、丁香酸為3.284～210.2 μg·mL-1、對香豆酸為2.423～155.1 μg·mL-1、阿魏酸為3.314 ～212.1 μg·mL-1、菊苣酸為12.27～785.2 μg·mL-1的系列標準溶液，進樣10 μL，測定，按“2.1”項色譜條件，記錄色譜圖，獲取色譜峰面積，以色譜峰峰面積(Y)為縱坐標，以對照品溶液濃度(X)為橫坐標繪制標準曲線，進行線性回歸分析。結(jié)果見表1，各組分在其相應的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2> 0.999 6)。

表1 紫錐菊提取物中7種酚酸類成分的標準曲線與線性范圍

Tab.1 Standard curve and linear range of seven phenolic acids in Echinacea extract

化合物線性方程R2線性范圍/(μg·mL-1)3,4-二羥基苯甲酸Y=8.295 5X-1.495 50.999 91.627～104.2綠原酸Y=8.787 6X+2.801 30.999 85.704～365.1咖啡酸Y=20.783X+6.612 30.999 73.319～212.4丁香酸Y=17.599X+10.6320.999 73.284～210.2對香豆酸Y=25.289X+3.639 80.999 82.423～155.1阿魏酸Y=18.645X-2.236 40.999 93.314～212.1菊苣酸Y=11.463X-126.090.999 612.270～785.2

2.5精密度實驗 取同一混合對照品溶液，按“2.1”項色譜條件連續(xù)進樣6次，進行測定，記錄化合物1-7各對照品的峰面積，并計算各峰面積的相對標準偏差值(RSD)。結(jié)果RSD分別為2.04%，2.16%，2.06%，1.98%，2.00%，2.02%，1.27%，結(jié)果表明本實驗所用儀器精密度良好。

2.6重復性實驗 取同一產(chǎn)地(陜西)紫錐菊藥材粉末6份，每份10 g，精密稱定，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，測定7種酚酸成分的峰面積，外標法計算濃度及其RSD值。結(jié)果化合物1-7濃度的RSD值分別為1.15%，0.86%，2.04%，0.37%，1.98%，1.60%，0.96%，結(jié)果表明本實驗提取測定方法重復性良好。

2.7穩(wěn)定性實驗 取同一混合對照品溶液，室溫放置，分別在0，2，4，6，8，12 h分別進樣10 μL，按“2.1”項色譜條件進樣分析，外標法計算各時間隔點7種酚酸成分的濃度，并與0 h的濃度比較，計算RE值。結(jié)果見表2，表明7種酚酸在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8加樣回收率實驗 取同一產(chǎn)地(陜西)紫錐菊藥材粉末6份，每份5 g，精密稱定，加入適量化合物1-7到供試樣品中，按“2.2”項下方法制備供試品溶液。按“2.1”項下色譜條件進樣分析，獲取色譜峰面積，外標法計算濃度，計算各酚酸成分的加樣回收率及RSD值。結(jié)果顯示加入7種酚酸成分樣品的平均加樣回收率為98.41%～101.9%，RSD<3.0%，表明本實驗方法準確可靠。

2.9樣品測定 取不同產(chǎn)地同一季節(jié)采收的紫錐菊藥材各10 g，精密稱定，按“2.2”項方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進行分析，記錄色譜峰面積，用外標法計算各產(chǎn)地紫錐菊提取物中7種酚酸成分的含量及總酚含量。結(jié)果見表3。

表2 7種酚酸穩(wěn)定性實驗結(jié)果

2.10不同產(chǎn)地紫錐菊提取物中7種酚酸類成分的聚類分析 聚類分析是一種依據(jù)研究對象(樣品或指標)的特征，對其進行分類的方法，以減少研究對象的數(shù)目。本實驗根據(jù)所測不同產(chǎn)地紫錐菊提取物中7種酚酸成分的定量分析數(shù)據(jù)，使用SPSS 22.0版統(tǒng)計軟件處理，選用離差平方和法(Ward法)，平方歐式距離(Squared Euclidean distance)作為樣品的測度，進行層次聚類分析。得到不同產(chǎn)地紫錐菊提取物中7種酚酸類成分含量的樹狀聚類圖譜，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，樣本層次聚類分析結(jié)果根據(jù)不同產(chǎn)地紫錐菊提取物中酚酸類成分含量的不同大體可以分為兩類：樣本3，7，1，2是一類，說明這類紫錐菊提取物中7種酚酸類成分含量基本相近，剩余樣本為一類。剩余樣本也可以繼續(xù)細分：樣本6，13，14為一類，樣本4，8，10為一類，樣本5，9，12，15，11為一類。從分析結(jié)果可以看出，不同地區(qū)的樣品各自聚為一類，說明紫錐菊提取物中酚酸類成分含量顯然與地域分布有關(guān)。

3 討論

3.1色譜條件的選擇 實驗中進行色譜條件的優(yōu)化，由于7種酚酸類成分極性相近，為了達到良好的分離度，本實驗采用梯度洗脫。結(jié)合文獻，考察不同流動相對樣品分離效果的影響。有機相采用甲醇-水相考察0.1%磷酸水溶液、0.2%磷酸水溶液和0.5%磷酸水溶液，分別組合挑選最優(yōu)流動相。經(jīng)過多次調(diào)整洗脫條件，最終確定以甲醇-0.1%磷酸水溶液系統(tǒng)作為流動相，7種酚酸類成分得到較好地分離，且柱效較高，拖尾現(xiàn)象得到改善。針對酚酸類成分母核中含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)，選用DAD檢測器進行測定，在280 nm波長處各組分均有較大的吸收，確定為檢測波長。

3.2測定結(jié)果分析 表3數(shù)據(jù)顯示不同產(chǎn)地紫錐菊提取物的酚酸含量參差不齊，其中陜西產(chǎn)地紫錐菊提取物的酚酸總含量最高，而湖南的最低，兩者含量相差明顯。同時紫錐菊提取物中菊苣酸含量相比于其他成分要高，其次是綠原酸和咖啡酸，說明這3種成分是紫錐菊提取物中主要的酚酸類成分?？偟膩碚f，紫錐菊提取物中總酚酸及指標性成分菊苣酸、綠原酸和咖啡酸的含量因產(chǎn)地不同而不同，初步推測是由于藥材的生長環(huán)境，采摘、干燥和貯存等環(huán)節(jié)中存在差異造成的?！睹绹幍洹分胁捎脴藴侍崛∥锒ㄐ裕瑢G原酸對照品及一測多評校正因子進行定量，加和，計算總酚酸含量，三者總含量不少于4%。本研究采用直接測定法測定7種酚酸類成分的含量，15個產(chǎn)地酚酸總含量均未達到4%，最高僅約為1%。初步分析其原因可能有：一是引種地與原產(chǎn)地的自然條件存在差異，可能造成酚酸類成分含量變化；二是采摘時期、貯存場所、干燥方式等藥材處理不規(guī)范造成酚酸類成分的降解；三是在紫錐菊引種馴化過程中生物學因素，如遺傳特性等改變也會造成體內(nèi)次級代謝產(chǎn)物的變化。

表3 不同產(chǎn)地紫錐菊提取物中7種酚酸類成分的含量測定結(jié)果

1.安徽；2.江蘇；3.湖北；4.云南；5.河南；6.甘肅；7.湖南；8.四川；9.山西；10.廣西；11.北京；12.河北；13.新疆；14.陜西；15.山東。

圖2 15個產(chǎn)地紫錐菊提取物中7種酚酸類成分含量聚類分析樹狀圖

1.Anhui；2.Jiangsu；3.Hubei；4.Yunnan；5.Henan；6.Gansu；7.Hunan；8.Sichuan；9.Shanxi；10.Guangxi；11.Beijing；12.Hebei；13.Xinjiang；14.Shaanxi；15.Shandong.

Fig.2 Tree diagram of clustering analysis on the contents of seven phenolic acids in Echinacea extracts from 15 habitats

因不同產(chǎn)地紫錐菊提取物中酚酸類成分的含量數(shù)據(jù)比較分散，對其相似程度進行直觀比較，很難做出相應的結(jié)論。為獲得準確的結(jié)論，本研究利用化學識別模式中的聚類分析方法對分散的數(shù)據(jù)標準化處理，按紫錐菊藥材產(chǎn)地進行分類歸納。由圖2可知，紫錐菊提取物中酚酸類成分含量的聚類顯示出一定的地域相關(guān)性，根據(jù)樣本層次聚類分析結(jié)果大體上可以分為兩類：樣本湖北、湖南、安徽、江蘇是一類，剩余樣本為一類，表明相鄰省份提取物含量相近。聚類分析結(jié)果可為紫錐菊藥材質(zhì)量的一致性和合理種植提供實驗依據(jù)。