刁婷婷，張雨晨，陳創(chuàng)，張朵朵，梅雨，吳一昊，呂偉，閔清

(1.湖北科技學院藥學院，咸寧 437100；2.湖北省咸寧市中心醫(yī)院藥學部，咸寧 437100)

山楂葉為薔薇科植物山里紅(CrataeguspinnatifidaBge.var.major N.E.Br.)或山楂(CrataeguspinnatifidaBge.)的干燥葉，《中華人民共和國藥典》2015年版記載山楂葉味酸，性平，歸脾、胃、肝經(jīng)；具有活血化瘀，理氣通脈，化濁降脂的功能，用于氣滯血瘀、胸痹心痛、胸悶憋氣、心悸健忘、眩暈耳鳴、高脂血癥[1]。研究發(fā)現(xiàn)，山楂葉提取物中主要成分為山楂葉總黃酮(Hawthorn leaves flavonoids，HLF)，包括槲皮素、金絲桃苷、黃酮苷、葒草素、葡荊牡黃酮等多種黃酮類化合物[2]，是一種作用廣泛、不良反應較少的天然藥物。現(xiàn)代研究表明，HLF在心、腦血管，糖尿病及其并發(fā)癥，肝細胞的修復等方面具有很好的藥理作用[3]。

前人在研究HLF調節(jié)血脂的作用時，在實驗中大多是對動物血液中對應指標進行檢測和研究。楊宇杰等[4]研究表明，山楂葉總黃酮可明顯降低高脂血癥模型血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，提高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。劉全亮等[5]研究表明，不同純度山楂葉總黃酮均可以降低高脂血癥模型小鼠的TC和TG水平，降低小鼠體質量，高純度山楂葉總黃酮優(yōu)于低純度。筆者在前人實驗基礎上，建立高脂血癥動物模型，觀察HLF對高脂血癥大鼠血脂含量和肝臟功能的影響，通過測定肝臟組織中腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)和乙酰輔酶A羧化酶(acetyl carboxylase，ACC)的蛋白表達水平，探討HLF對高脂血癥大鼠調節(jié)血脂及肝臟的影響及其可能機制，為HLF的進一步開發(fā)提供相關實驗資料。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級SD雄性大鼠，體質量170～220 g，由遼寧長生生物技術股份有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(遼)2015-0001。動物房溫度(22±2)℃，濕度55%～60%，大鼠自由飲水、攝食。高脂飼料(20180604)由北京博泰宏達生物技術有限公司提供，主要含蛋白質24.2%，碳水化合物42.1%，脂肪25.4%，粗纖維5.5%，鈣1.7%，磷1.1%?；A飼料由武漢萬千嘉興公司提供，主要含玉米40%，豆粕20%，進口魚粉7%，面粉23%，進口酵母3.5%，復合礦物鹽4%，復合維生素0.2%，復合氨基酸0.8%，油1.5%。

1.2藥品與試劑 山楂葉總黃酮(臨沂愛康藥業(yè)有限公司，批號：AKH16-3，含量為93.5%)；辛伐他汀片(杭州默沙東制藥有限公司，批準文號：國藥準字J2913068)；TG試劑盒(批號：20180731)、TC試劑盒(批號：20180731)、HDL-C試劑盒(批號：20180817)、LDL-C試劑盒(批號：20180816)、油紅O染液(批號：20180815)均購自南京建成生物工程研究所；ACC抗體(產(chǎn)品編號：AF1867)、p-ACC抗體(產(chǎn)品編號：AA110)、AMPK抗體(產(chǎn)品編號：AF1627)、p-AMPK抗體(產(chǎn)品編號：AF2677)、β-Actin抗體(產(chǎn)品編號：AF0003)均購自碧云天試劑有限公司。

1.3動物分組 將SD雄性大鼠，采用隨機數(shù)字表法分為正常對照組、模型對照組、辛伐他汀組及HLF小、中、大劑量組，每組8只。

1.4造模及給藥 參照文獻[6]的方法，制備高脂血癥大鼠模型，檢測大鼠血漿中TC和TG含量，確定高脂血癥大鼠模型建立是否成功。適應性飼養(yǎng)1周后，正常對照組大鼠給予基礎飼料，其余各組大鼠給予高脂飼料，造模8周。高脂飼料喂養(yǎng)的同時給予藥物干預。辛伐他汀組給予辛伐他汀4 mg·kg-1，HLF小、中、大劑量組給予HLF，劑量分別為100，200，400 mg·kg-1，正常對照組和模型對照組給予純化水1 mL·(100 g)-1，每天1次，連續(xù)灌胃給藥8周。

1.5生化指標與肝臟指數(shù)測定 末次給藥后禁食不禁水12 h，麻醉，腹主動脈取血，4 ℃，3500 r·min-1離心15 min，收集血漿。處死大鼠，摘取肝臟，稱質量并計算肝臟指數(shù)，肝臟指數(shù)(%)=肝臟濕質量/大鼠體質量×100%。取部分肝臟組織制備肝勻漿，待測。按照試劑盒說明書測定大鼠血漿中的TG、TC、HDL-C、LDL-C含量及肝勻漿中TG、TC含量，觀察HLF對高脂血癥大鼠血脂的影響。

1.6蘇木精-伊紅(HE)染色觀察肝臟組織病理學改變 將分離的大鼠肝右葉條形組織塊用4%緩沖多聚甲醛固定48 h后，制作病理切片，進行HE染色，光學顯微鏡下觀察各組大鼠肝臟組織病理學變化。

1.7油紅O染色觀察肝臟脂質聚集情況 將分離的各組大鼠肝臟組織用4%多聚甲醛緩沖液固定48 h后，放到10%、20%、30%蔗糖溶液梯度脫水，直至組織沉底。然后用聚乙二醇/聚乙烯醇混合物(OTC)包埋后于-20 ℃條件下進行冷凍切片，按照油紅O染液試劑盒說明書進行染色，光學顯微鏡下觀察各組大鼠肝臟脂質聚集情況。

1.8Western blotting法分析肝臟AMPK、p-AMPK、ACC、p-ACC蛋白表達 將大鼠肝臟組織塊剪成小塊置于勻漿器，加入裂解液，冰上操作充分勻漿使其裂解完全，4 ℃，12000 r·min-1，離心15 min，收集上清液。BCA法測蛋白濃度，取調整好蛋白濃度的樣本上樣，按照電泳程序進行電泳、轉膜。轉膜結束后，5%脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃孵育一抗過夜，洗滌3次，室溫搖動孵育二抗1.5 h，洗滌3次，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，分析數(shù)據(jù)。

2 結果

2.1動物一般情況 正常對照組大鼠毛發(fā)光滑，飲食活動正常，體質量正常，精神狀態(tài)良好。模型對照組大鼠體質量增加量高于正常對照組，實驗前期毛發(fā)粗糙，微黃色，活躍程度下降。各給藥組大鼠生長較正常，體質量略有增長，飲食活動較正常，精神狀態(tài)較好。

2.2HLF對高脂血癥大鼠肝臟指數(shù)的影響 結果見表1。與正常對照組比較，模型對照組大鼠肝臟指數(shù)顯著升高(P<0.01)，說明高脂飼料使得肝臟被脂肪浸潤，損傷肝臟，提示高脂血癥大鼠模型成立；與模型對照組比較，HLF小、中、大劑量組和辛伐他汀組肝臟指數(shù)均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，并具有一定的濃度依賴性，說明HLF能夠明顯減輕肝臟的脂肪浸潤，改善肝功能。

表1 6組大鼠肝臟指數(shù)檢測值

組別劑量/(mg·kg-1)肝臟質量/g肝臟指數(shù)/%正常對照組-6.3±0.692.01±0.1模型對照組-11.6±1.122.59±0.12①辛伐他汀組810.4±1.202.41±0.19②HLF 小劑量組10010.1±1.102.31±0.21③ 中劑量組2008.9±0.792.27±0.12③ 大劑量組4009.0±0.492.24±0.11③

①與正常對照組比較，t=10.06，P<0.01；②與模型對照組比較，t=2.19，P<0.05；③與模型對照組比較，t=3.18，5.06，6.02，P<0.01。

①Compared with normal control group，t=10.06，P<0.01；②compared with model control group，t=2.19，P<0.05；③compared with model control group，t=3.18，5.06，6.02，P<0.01.

2.3HLF對高脂血癥大鼠血漿血脂的影響 結果見表2。與正常對照組比較，第8周模型對照組大鼠血漿中TG、TC以及LDL-C含量明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明高脂血癥大鼠模型建立成功，HDL-C含量低于正常對照組，但差異無統(tǒng)計學意義；與模型對照組比較，第8周HLF小劑量組和辛伐他汀組大鼠血漿中TG、TC以及LDL-C含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)，并具有一定的濃度依賴性，其中，HLF中、大劑量組大鼠血漿中TG、TC以及LDL-C含量極顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.4HLF對高脂血癥大鼠肝臟脂肪含量的影響 結果顯示，正常對照組大鼠肝細胞結構正常，胞質呈藍色，未見明顯紅色脂滴；與正常對照組比較，模型對照組大鼠肝細胞內出現(xiàn)大量大小不等的紅色脂滴，在切片的視野內可以觀察到整個肝臟切面的大面積的脂滴分布；與模型對照組比較，HLF小、中、大劑量組和辛伐他汀組大鼠肝細胞紅色脂滴明顯減少，且HLF大劑量組大鼠肝細胞內紅色脂滴減少較HLF小、中劑量組更明顯。見圖1。

2.5HLF對高脂血癥大鼠肝臟病理變化的影響 結果顯示，正常對照組大鼠肝小葉和肝細胞索結構完整、清晰，肝細胞大小均勻，無明顯脂肪變性；與正常對照組比較，模型對照組的大鼠肝細胞內出現(xiàn)較多大小不等的脂肪滴，部分肝細胞核被脂肪滴擠壓而明顯偏位，脂質沉積和肝臟脂肪變性程度較為嚴重；與模型對照組比較，HLF小、中、大劑量組和辛伐他汀組肝小葉和肝細胞索結構較為清晰，且肝細胞內脂質沉積和肝臟脂肪變性程度明顯減輕。見圖2。

表2 6組大鼠血漿血脂的檢測值

Tab.2 Plasma Lipid of six groups of rats

組別劑量/(mg·kg-1)TGTCHDL-CLDL-C正常對照組-0.65±0.061.48±0.351.24±0.110.50±0.11模型對照組-1.07±0.10①3.80±0.34①1.11±0.201.26±0.03①辛伐他汀組80.64±0.12②2.14±0.32②1.17±0.260.93±0.14②HLF 小劑量組1000.83±0.07②3.23±0.44③1.22±0.241.10±0.07③ 中劑量組2000.81±0.13②2.85±0.46②1.27±0.211.03±0.08② 大劑量組4000.70±0.18②2.65±0.37②1.27±0.150.89±0.06②

①與正常對照組比較，t=10.71，14.15，19.16，P<0.01；②與模型對照組比較，P<0.01；③與模型對照組比較，P<0.05。

①Compared with normal control group，t=10.71，14.15，19.16，P<0.01；②compared with model control group，P<0.01；③compared with model control group，P<0.05.

A.正常對照組；B.模型對照組；C.辛伐他汀組；D.HLF小劑量組；E.HLF中劑量組；F.HLF大劑量組。

A.normal control group；B.model control group；C.simvastatin group；D.low-dose HLF group；E.media-dose HLF group；F.high-dose HLF group.

Fig.1 Oil red O staining of liver tissues in six groups of rats (×400)

A.normal control group；B.model control group；C.simvastatin group；D.low-dose HLF group；E.media-dose HLF group；F.high-dose HLF group.

Fig.2 Image of HE staining on liver tissues in six groups of rats (×400)

2.6HLF對高脂血癥大鼠肝臟AMPK、ACC蛋白表達的影響 與正常對照組比較，模型對照組大鼠AMPK蛋白表達顯著性下調(P<0.01)；與模型對照組比較，HLF小，中，大劑量組及辛伐他汀組AMPK蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義。與正常對照組比較，模型對照組大鼠p-AMPK/AMPK蛋白表達顯著性下調(P<0.01)；與模型對照組比較，HLF大劑量組及辛伐他汀組p-AMPK/AMPK蛋白表達顯著性上調(P<0.05或P<0.01)，但HLF小、中劑量組表達差異無統(tǒng)計學意義。與正常對照組比較，模型對照組大鼠ACC蛋白表達顯著性上調(P<0.01)；與模型對照組比較，HLF小、中、大劑量組及辛伐他汀組ACC蛋白表達均差異無統(tǒng)計學意義。與正常對照組比較，模型對照組大鼠p-ACC/ACC蛋白表達顯著性上調(P<0.01)；與模型對照組比較，HLF小、中、大劑量組及辛伐他汀組p-ACC/ACC蛋白表達均顯著性下調(P<0.05或P<0.01)，其中HLF大劑量組p-ACC/ACC蛋白表達下調最為明顯。見圖3。

3 討論

高脂血癥是由各種原因導致血漿中TC、TG和(或) LDL-C過高或HDL-C過低的一種脂代謝異常性疾病，又被稱為脂質異常血癥[7]。近年來，隨著生活水平的提高，人們飲食結構的改變，高脂血癥已嚴重危害人類的身體健康，長期血脂過高引發(fā)機體代謝紊亂，進而產(chǎn)生動脈粥樣硬化、冠心病、心肌梗死等心腦血管疾病，已成為全球人類健康“第一殺手”[8]。

高脂血癥的預防以及治療對降低慢性病特別是由脂質代謝異常引起的心血管疾病、肥胖以及糖尿病等是有效的。盡管西藥在調脂方面一直占據(jù)主導地位，但是高脂血癥患者使用西藥時的不良反應以及部分患者的不耐受性，使得人們對中醫(yī)藥治療高脂血癥越來越感興趣。中醫(yī)藥治療高脂血癥的優(yōu)勢在于其價格便宜，效果與西藥藥效相當，且副作用少[9-15]。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.辛伐他汀組；D.HLF小劑量組；E.HLF中劑量組；F.HLF大劑量組；①與正常對照組比較，P<0.01；②與模型對照組比較，P<0.01；③與模型對照組比較，P<0.05。

A.normal control group；B.model control group；C.simvastatin group；D.low-dose HLF group；E.media-dose HLF group；F.high-dose HLF group；①Compared with normal control group，P<0.01；②compared with model control group，P<0.01；③compared with model control group，P<0.05.

肝臟是體內代謝的重要器官之一，肝組織內含有多種代謝酶，參與機體各種代謝活動。AMPK被譽為“細胞能量感受器”[16]，是一種廣泛存在的絲氨酸/蘇氨酸激酶，對細胞內脂質代謝具有重要的調節(jié)作用，p-AMPK/AMPK是生物能量代謝調節(jié)的關鍵分子，是研究高脂血癥及其他代謝相關疾病的核心。ACC可以催化乙酰輔酶A生成丙二酸單酰輔酶A，是脂肪合成的限速酶[17]，后兩者均為前者的下游效應因子，ACC/p-ACC在脂肪酸的合成速度調節(jié)中此起著主要作用。大量研究表明，激活AMPK，抑制ACC可以改善和治療高脂血癥[18]。

本實驗通過高脂飼料建立的高脂血癥大鼠模型來評價HLF的調節(jié)血脂作用及其機制。經(jīng)過高脂飼料誘導后，與正常對照組比較，高脂血癥大鼠血漿中TC含量大幅提高(P<0.01)，血清TG含量也大幅提高(P<0.01)，血清LDL-C含量提高(P<0.01)，肝臟指數(shù)升高，肝臟酯滴沉積明顯，提示造模成功。給予HLF小、中、大劑量后，SD大鼠血清TC、TG、LDL-C的含量均明顯降低(P<0.05或P<0.01)，肝臟指數(shù)顯著降低(P<0.05或P<0.01)，肝臟脂滴沉積明顯減少，提示HLF具有調節(jié)血脂作用。

綜上所述，HLF可調節(jié)高脂血癥大鼠血脂水平，減輕肝臟的脂肪浸潤，通過調節(jié)AMPK/ACC通路在大鼠肝臟中的蛋白表達水平，并具有一定的濃度依賴性，提示其調節(jié)血脂的可能機制為：通過誘導體內p-AMPK和抑制p-ACC的表達，增加脂肪酸氧化，抑制膽固醇和減少脂肪合成來改善高脂血癥。