張立攀,趙夢(mèng)瑤,周 莉,李鵬沖,高火亮,王法云

(河南省商業(yè)科學(xué)研究所有限責(zé)任公司,河南鄭州 450000)

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生活水平提高,人們的健康養(yǎng)生觀念不斷提升,藥食同源觀念逐漸受到人們重視。在我國(guó),藥食同源具備獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),早在2000多年前的《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就提出了“藥食同源、未病先防”的觀點(diǎn)[1]。中國(guó)同時(shí)具有悠久的飲食和中醫(yī)藥文化,形成了獨(dú)具特色的藥食同源營(yíng)養(yǎng)保健理念[2-3]。山茱萸(CornusofficinalisSieb. et Zucc),是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材,有著悠久的用藥歷史,最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,有補(bǔ)益肝腎、澀精固脫的功效[4-6]。山茱萸在我國(guó)河南、陜西、山西、四川等地均有分布,在當(dāng)?shù)卮嬖陂L(zhǎng)期食用的歷史,如煲湯、做菜或制作果酒等,未見不良反應(yīng)報(bào)道[7-8]。2018年國(guó)家衛(wèi)健委發(fā)布《關(guān)于征求將黨參等9種物質(zhì)作為按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材物質(zhì)管理意見的函》,將山茱萸照藥食物質(zhì)進(jìn)行試生產(chǎn),山茱萸將獲批為藥食同源物質(zhì)。

山茱萸作為傳統(tǒng)中藥材,以往的研究多集中在藥用方面[9-10]。從普通和功能食品角度研究山茱萸,對(duì)其作為藥食同源物質(zhì)的開發(fā)利用,具有積極的意義。山茱萸營(yíng)養(yǎng)豐富,含有葡萄糖、蛋白質(zhì)和氨基酸等多種人體必需的營(yíng)養(yǎng)成分[11-12];同時(shí),還含有環(huán)烯醚萜類、皂苷、多糖、熊果酸、齊墩果酸、鞣質(zhì)等[8,13-15]等活性物質(zhì)。熊果酸是山茱萸重要的質(zhì)控指標(biāo),除了具有降低血糖[16-19]、抗菌[16,20-21]、抗炎[16,20-23]和抗癌[20]等生物活性,還具有明顯的抗氧化功能,是優(yōu)良的天然抗氧化劑和抑菌劑[23-26]。研究表明[13],氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)人體衰老和健康具有非常重大的影響,各種因素導(dǎo)致的過量自由基可以引發(fā)一系列的健康問題。因此,應(yīng)用抗氧化劑對(duì)維持人體健康、延緩衰老有著積極的作用[9,13],抗氧化型功能食品是開發(fā)功能食品的重要方向[27]。因此,研究山茱萸熊果酸提取工藝及抗氧化、抗菌性能,對(duì)開發(fā)山茱萸在功能食品領(lǐng)域的應(yīng)用,充分利用該藥食同源資源,有積極的意義。

目前熊果酸的提取方法主要有:有機(jī)溶劑回流提取、微波提取、超臨界萃取等[28-29],這些方法存在工藝復(fù)雜、效率較低等缺點(diǎn)。本文采用超聲細(xì)胞破碎法,通過單因素及正交試驗(yàn)對(duì)從山茱萸中提取熊果酸的工藝進(jìn)行了優(yōu)化,同時(shí)對(duì)山茱萸熊果酸體外抗氧化性和抑菌活性進(jìn)行了評(píng)價(jià),為研究開發(fā)山茱萸熊果酸相關(guān)功能食品,提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山茱萸 河南省洛陽市欒川縣山區(qū),野生;熊果酸 HPLC≥98%,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、變形桿菌、枯草桿菌和黑曲霉菌 河南省商業(yè)科學(xué)研究所有限責(zé)任公司微生物實(shí)驗(yàn)室提供;無水乙醇、乙酸乙酯 分析純,天津市富宇精細(xì)化工有限公司;香蘭素 分析純,天津市福晨化學(xué)試劑廠;冰乙酸 分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;高氯酸 分析純,州派尼化學(xué)試劑公司;DPPH(2,2-二苯基-1-三硝基苯肼) 99%,Sigma-Aldrich;抗壞血酸(VC) 99%,國(guó)藥集團(tuán);M-H藥敏試驗(yàn)瓊脂平板 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;豬油 買自市場(chǎng),新鮮煉得;其余試劑 均為市售分析純。

FA2004電子天平 上海衡際科學(xué)儀器有限公司;QJ-08B粉碎機(jī) 上海兆申科技有限公司;DHG-9052A臺(tái)式電熱干燥箱 上海捷呈實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;SCIENTZ-IID超聲細(xì)胞破碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;AL204-ICF分析天平 梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司;RE-2000A快速旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;UV-8000ST雙光束紫外可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;KW-1000DC恒溫水浴鍋 江蘇中大儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 取成熟的山茱萸鮮果,經(jīng)清洗處理后在-2 ℃冷凍處理25 h,然后將冷凍后的山茱萸鮮果直接加入75 ℃的熱水中煮3 min后撈出,進(jìn)行脫核處理,得到山茱萸果肉;自然晾干后,粉碎機(jī)磨碎后過40目篩,于50 ℃烘干(8 h),得到山茱萸干果粉[30]。

1.2.2 山茱萸中熊果酸的超聲波輔助提取工藝 稱取一定質(zhì)量的山茱萸干果粉,加入一定濃度和體積的溶劑中;然后,按照一定的超聲浸提時(shí)間、超聲浸提溫度和超聲浸提次數(shù)進(jìn)行提取。提取物經(jīng)過濾,少量溶劑潤(rùn)洗濾渣;所有濾液合并旋干,殘留物用60%乙醇(體積比)溶解,并定容至250 mL容量瓶中,為樣品待測(cè)儲(chǔ)備液。

1.2.3 山茱萸熊果酸超聲輔助提取單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 超聲浸提時(shí)間對(duì)熊果酸得率的影響 溶劑中乙醇濃度恒定取60%,功率取200 W,料液比取1∶20 (g/mL),超聲浸提溫度取40 ℃,工作/間歇時(shí)間比取5 s/5 s,超聲浸提次數(shù)1次,超聲浸提時(shí)間分別取10、15、20、25、30 min,進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn),考察超聲浸提時(shí)間對(duì)熊果酸得率的影響。

1.2.3.2 溶劑中乙醇濃度對(duì)熊果酸得率的影響 功率取200 W,料液比取1∶20 (g/mL),超聲浸提時(shí)間取25 min,超聲浸提溫度取40 ℃,工作間歇時(shí)間比取5 s/5 s,浸提次數(shù)1次,溶劑中乙醇濃度分別取40%、50%、60%、70%和80%,進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn),考察溶劑中乙醇濃度對(duì)熊果酸得率的影響。

1.2.3.3 超聲功率對(duì)熊果酸得率的影響 溶劑中乙醇濃度恒定取50%,料液比取1∶20 (g/mL),超聲浸提溫度取40 ℃,超聲浸提時(shí)間取25 min,工作/間歇時(shí)間比取5 s/5 s,浸提次數(shù)1次,功率分別取100、150、200、250、300 W,進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn),考察超聲功率對(duì)熊果酸得率的影響。

1.2.3.4 超聲浸提溫度對(duì)熊果酸得率的影響 溶劑中乙醇濃度恒定取50%,功率取200 W,超聲浸提時(shí)間取25 min,料液比取1∶20 (g/mL),工作間歇/時(shí)間比取5 s/5 s,浸提次數(shù)1次,超聲浸提溫度分別取 20、30、40、50、60 ℃,進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn),考察超聲浸提溫度對(duì)熊果酸得率的影響。

1.2.3.5 料液比對(duì)熊果酸得率的影響 溶劑中乙醇濃度恒定取50%,功率取200 W,超聲浸提時(shí)間取25 min,超聲浸提溫度取40 ℃,工作/間歇時(shí)間比取5 s/5 s,浸提次數(shù)1次,料液比分別取1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 (g/mL),進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn),考察料液比對(duì)熊果酸得率的影響。

1.2.3.6 工作/間歇時(shí)間比對(duì)熊果酸得率的影響 溶劑中乙醇濃度恒定取50%,功率取200 W,超聲浸提時(shí)間取25 min,超聲浸提溫度取40 ℃,料液比取1∶25 (g/mL),浸提次數(shù)1次,工作/間歇時(shí)間比分別取1 s/5 s、3 s/5 s、5 s/5 s、7 s/5 s、9 s/5 s、10 s/5 s,進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn),考察工作/間歇時(shí)間比對(duì)熊果酸得率的影響。

1.2.3.7 浸提次數(shù)對(duì)熊果酸得率的影響 溶劑中乙醇濃度恒定取50%,功率取200 W,超聲浸提時(shí)間取25 min,超聲浸提溫度取40 ℃,料液比取1∶25 (g/mL),工作間歇時(shí)間比取7 s/5 s,浸提次數(shù)分別取1、2、3、4,進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn),考察浸提次數(shù)對(duì)熊果酸得率的影響。

1.2.4 山茱萸熊果酸超聲波輔助提取的正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,固定超聲浸提溫度為40 ℃,料液比為1∶25 (g/mL),浸提次數(shù)為2次,以熊果酸得率為正交試驗(yàn)的評(píng)價(jià)指標(biāo),選取時(shí)間、乙醇濃度、功率和超聲工作/間歇時(shí)間比四個(gè)因素設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.5 熊果酸得率的測(cè)定

1.2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用分光光度法測(cè)量[16]。稱取約0.02 g熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品,用無水乙醇定容至50 mL容量瓶中,得到熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.7 mL熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL比色管,加熱去除乙醇。冷卻后,分別加入0.8 mL 5%香蘭素冰乙酸溶液、2 mL高氯酸。放置于60 ℃水浴中保溫30 min左右,冷卻至室溫,用乙酸乙酯定容至10 mL。在波長(zhǎng)546 nm處測(cè)定吸光度,以吸光度和濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定熊果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=37.862x-0.0188,R2=0.9991。

1.2.5.2 熊果酸含量的測(cè)定 吸取0.5 mL樣品儲(chǔ)備液加入到10 mL比色管,加熱去除乙醇。冷卻后,分別加入0.8 mL 5%香蘭素冰乙酸溶液、2 mL高氯酸。放置于60 ℃水浴中保溫30 min左右,冷卻至室溫,用乙酸乙酯定容至10 mL。在波長(zhǎng)546 nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)式(1)計(jì)算山茱萸提取物熊果酸得率。

式(1)

式中:w為熊果酸得率,%;c為測(cè)定液中熊果酸的濃度,mg/mL;m為稱取的山茱萸粉樣品的質(zhì)量,g;5為換算系數(shù)。

1.2.6 山茱萸熊果酸的初步提純 參考文獻(xiàn)[16]并進(jìn)行修改。采取正交優(yōu)化后的組合條件得到山茱萸熊果酸提取液,將該儲(chǔ)備液濃縮至原體積的三分之一以下,靜置,以轉(zhuǎn)速4000 r/min離心15 min得到沉淀物1;使用無水乙醇在超聲下重新溶解沉淀物,然后加入1∶1體積的水,靜置沉淀,經(jīng)3000 r/min離心10 min后得到沉淀物2,經(jīng)水洗,在50 ℃下真空干燥后,得到初步提純的熊果酸,用無水乙醇以1 g∶2000 mL的比例制成待測(cè)液,按照1.2.5.2進(jìn)行熊果酸純度的測(cè)定。初步提純的山茱萸熊果酸,可用于活性測(cè)定研究。

1.2.7 山茱萸熊果酸體外抗氧化活性測(cè)定

1.2.7.1 還原能力 以山茱萸熊果酸初步提純產(chǎn)物作為樣品,參考文獻(xiàn)[31],以相同濃度的VC溶液作陽性對(duì)照,進(jìn)行還原能力的測(cè)定,還原能力計(jì)算按如下公式:

H=A1-A2

式中:H:還原能力;A1:樣品吸光度;A2:空白組吸光度。

1.2.7.2 清除DPPH·能力 參考文獻(xiàn)[32]的方法,用無水乙醇代替甲醇,配制0.1 mmol/L 的DPPH溶液,移取1 mL不同濃度的樣品溶液于10 mL試管中,加入2 mL蒸餾水和2 mL DPPH溶液,搖勻后室溫放置 20 min,于517 nm測(cè)吸光值A(chǔ)4,相同體積的蒸餾水和DPPH溶液混勻后的吸光值為A0,1 mL樣品溶液和2 mL蒸餾水與2 mL無水乙醇混勻后的吸光值為A3,平行測(cè)定3次,取平均值。以VC作陽性對(duì)照,按如下公式計(jì)算DPPH·的清除率:

式中,R:自由基清除率,%;A4:樣品吸光度;A3:對(duì)照組吸光度;A0:空白組吸光度。

1.2.7.3 清除·OH能力 參考文獻(xiàn)[33]的方法,取1.5 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液,分別加入1.0 mL 2.5 mmol/L的水楊酸溶液、1.0 mL 5 mmol/L的FeSO4溶液和2.0 mL蒸餾水,充分混勻,加入1.0 mL 5 mmol/L的H2O2,置于37 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min,再置于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度,以蒸餾水作空白對(duì)照,同時(shí)以VC作陽性對(duì)照。按如下公式計(jì)算·OH清除率:

羥自由基清除率(%)=[空白對(duì)照吸光度-(加H2O2樣品溶液吸光度-不加H2O2樣品溶液吸光度)]/空白對(duì)照吸光度×100

1.2.7.4 對(duì)豬油的抗氧化能力 參考文獻(xiàn)[34]的方法,以空白油脂為對(duì)照,將添加量為0.25%、0.5%和0.75%的山茱萸熊果酸與0.25% VC處理的豬油進(jìn)行對(duì)比;豬油樣品過氧化值測(cè)定參照GB/T 5538-2005 的碘量法,進(jìn)行測(cè)定。

1.2.8 山茱萸熊果酸抑菌試驗(yàn)

1.2.8.1 藥敏試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[21]的方法,取直徑為6 mm的無菌空白紙片,121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min,待用。取20 μL用無菌水制備的50 mg/mL熊果酸溶液,滴加于滅菌的空白紙片上,備用。采用紙片瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定抑菌活性,將菌株菌液調(diào)整為1.0×108CFU/mL,涂布于M-H平板上,將熊果酸紙片貼于 M-H 平板上,以無菌水作為空白對(duì)照,置于37 ℃培養(yǎng)箱 16～24 h,測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.8.2 MIC 測(cè)定 采用無菌MH肉湯培養(yǎng)基制備稀釋系列,用對(duì)倍稀釋法進(jìn)行測(cè)定。將山茱萸熊果酸配制成100、50、25、12.5、6.25、3.125 mg/mL藥液,以不加藥液為陽性對(duì)照,各試管的菌液接種量均為2×106CFU/mL,同時(shí)設(shè)置不加藥液、不接種菌的為陰性對(duì)照,37 ℃培養(yǎng) 24 h,取出觀察,以濃度低而無肉眼可見菌生長(zhǎng)的一管濃度為山茱萸熊果酸對(duì)該菌的MIC[35]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均平行進(jìn)行三次,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以Excel 2013進(jìn)行作圖和統(tǒng)計(jì)分析,正交試驗(yàn)以正交設(shè)計(jì)助手II V3.1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 超聲浸提時(shí)間對(duì)熊果酸得率的影響 由圖1可知,隨著超聲浸提時(shí)間的增加,熊果酸得率呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)浸提時(shí)間為25 min時(shí),得率最大。隨著時(shí)間的延長(zhǎng),進(jìn)入到溶劑中的熊果酸分子增多,但熊果酸與周圍溶劑之間存在傳質(zhì)平衡,當(dāng)平衡達(dá)到之后,再增加時(shí)間,由于其他雜質(zhì)的不斷溶出,反而對(duì)熊果酸的溶解產(chǎn)生了影響,導(dǎo)致熊果酸得率在25 min后呈下降趨勢(shì)[29]。故選擇浸提時(shí)間為25 min。

圖1 提取時(shí)間對(duì)山茱萸熊果酸提取得率的影響Fig.1 The effect of extraction time on the yield ofursolic acid from Cornus officinalis

2.1.2 乙醇濃度對(duì)熊果酸得率的影響 由圖2可知,隨著乙醇濃度的增加,熊果酸的提取得率增加,當(dāng)乙醇濃度為50%時(shí),達(dá)到最大值,再增加乙醇濃度,熊果酸得率反而下降。由相似相溶原理可知,當(dāng)溶劑極性與熊果酸的極性相近時(shí),熊果酸易于溶解。50%乙醇溶液的極性與熊果酸較為接近,而乙醇濃度減小或增大時(shí)都會(huì)導(dǎo)致極性相差變大,所以得率較低[29]。故選擇乙醇濃度為50%。

圖2 乙醇濃度對(duì)山茱萸熊果酸提取得率的影響Fig.2 The effect of alcohol concentration on theyield of ursolic acid from Cornus officinalis

2.1.3 超聲功率對(duì)熊果酸得率的影響 圖3顯示,隨著功率的增大,山茱萸中熊果酸的得率起初迅速上升,達(dá)到200 W時(shí),得率達(dá)到最大,之后反而呈下降的趨勢(shì)。功率超過200 W時(shí),由于細(xì)胞破碎程度過高,導(dǎo)致原本擴(kuò)散較慢的其他成分分子擴(kuò)散速率大幅提高,影響了熊果酸分子本身的擴(kuò)散速率,反而不利于熊果酸的提取。因此功率過大時(shí)得率反而下降。故選擇功率為200 W。

圖3 超聲功率對(duì)山茱萸熊果酸提取得率的影響Fig.3 The effect of ultrasonic power on theyield of ursolic acid from Cornus officinalis

2.1.4 溫度對(duì)熊果酸得率的影響 由圖4可知,得率隨著溫度的增大呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。在溫度為40 ℃時(shí)得率最大。當(dāng)溫度較低時(shí),分子擴(kuò)散速度較慢,進(jìn)入溶劑中的熊果酸分子較少,隨著溫度升高,分子運(yùn)動(dòng)加快,使得溶劑中熊果酸溶解增多。但溫度過高時(shí),部分多糖和蛋白質(zhì)物質(zhì)開始大量溶出,對(duì)熊果酸的溶解產(chǎn)生了抑制作用,導(dǎo)致得率降低。故選擇提取溫度為40 ℃。

圖4 溫度對(duì)山茱萸熊果酸提取得率的影響Fig.4 The effect of extraction temperature on theyield of ursolic acid from Cornus officinalis

2.1.5 料液比對(duì)熊果酸得率的影響 圖5顯示熊果酸得率隨料液比的變化趨勢(shì)。當(dāng)料液比由1∶15 (g/mL)變?yōu)?∶25 (g/mL)的過程中,隨著料液比的增加，擴(kuò)散進(jìn)入溶劑的熊果酸分子不斷增多,得率逐漸升高,在1∶25 (g/mL)時(shí)達(dá)到峰值;而料液比高于1∶25 (g/mL)后,其他雜質(zhì)的溶出增多,影響熊果酸分子的溶出程度,得率呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。故選擇料液比為1∶25 (g/mL)。

圖5 料液比對(duì)山茱萸熊果酸提取得率的影響Fig.5 The effect of ratio of solid to liquid on theyield of ursolic acid from Cornus officinalis

2.1.6 工作/間歇時(shí)間比對(duì)熊果酸得率的影響 由圖6可知,熊果酸得率隨著超聲工作/間歇時(shí)間比的增大呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)。超聲細(xì)胞破碎的過程中會(huì)釋放出能量使得體系溫度升高。當(dāng)間歇時(shí)間過短時(shí),體系溫度來不及降低,不利于條件控制;同時(shí),由于連續(xù)工作時(shí)間過長(zhǎng),超聲導(dǎo)致的分子碰撞作用力可能破壞熊果酸的物質(zhì)結(jié)構(gòu),反而使得總的得率下降[36]。而間歇時(shí)間過長(zhǎng)時(shí),實(shí)際工作的時(shí)間相對(duì)來說又縮短,導(dǎo)致得率都會(huì)受到影響。故選擇超聲工作/間歇時(shí)間比為7 s/5 s。

圖6 工作間歇時(shí)間比對(duì)山茱萸熊果酸提取得率的影響Fig.6 The effect of the ratio of treatment to intermissionon the yield of ursolic acid from Cornus officinalis

2.1.7 浸提次數(shù)對(duì)熊果酸得率的影響 由圖7可知,隨著浸提次數(shù)的增加,熊果酸得率增加。當(dāng)提取次數(shù)為2次時(shí),得率增加較大,繼續(xù)增加提取次數(shù),得率雖然仍呈現(xiàn)出增大的趨勢(shì),但增幅不明顯。故綜合考慮成本及操作的簡(jiǎn)便,選取浸提次數(shù)為2次。

圖7 浸提次數(shù)對(duì)山茱萸熊果酸提取得率的影響Fig.7 The effect of extraction times on theyield of ursolic acid from Cornus officinalis

2.2 山茱萸中熊果酸提取的正交試驗(yàn)

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,選取影響較大的超聲時(shí)間、乙醇濃度、超聲功率、超聲工作/間歇時(shí)間比這四個(gè)因素,選取不同的實(shí)驗(yàn)水平,設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)進(jìn)一步找出最佳的熊果酸提取工藝。正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

由表2可知,這四種因素對(duì)熊果酸提取的影響大小排序?yàn)?超聲時(shí)間>超聲工作/間歇時(shí)間比>超聲功率>乙醇濃度。通過表3可知,超聲時(shí)間和超聲工作/間歇時(shí)間比這兩個(gè)因素具有顯著性,說明其對(duì)采用超聲輔助法從山茱萸中提取熊果酸的影響較大,起到主要的作用。正交優(yōu)化所得到的最佳提取條件組合為A2B2C3D3,即提取時(shí)間為25 min,乙醇濃度為50%,超聲功率為225 W,超聲工作/間歇時(shí)間比為8 s/5 s。為驗(yàn)證正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)的結(jié)果,在此最優(yōu)條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn),得率平均值達(dá)到13.16%。

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

由最佳工藝得到提取物按照1.2.6進(jìn)行提純,所得山茱萸熊果酸的純度達(dá)78%,用于活性測(cè)定。

2.3 山茱萸熊果酸抗氧化活性

2.3.1 山茱萸熊果酸還原能力測(cè)定 還原能力是評(píng)價(jià)物質(zhì)抗氧化活性的重要指標(biāo)[30]。由圖8可知,山茱萸熊果酸具有明顯的還原能力,但在相同濃度下山茱萸熊果酸還原能力要弱于VC,并且0.04 mg/mL山茱萸熊果酸的還原能力與0.01 mg/mL的VC相當(dāng)。

圖8 山茱萸熊果酸的還原能力Fig.8 Reducing powers of ursolic acid from Cornus officinalis

2.3.2 山茱萸熊果酸對(duì)DPPH·清除能力 由圖9可知,山茱萸熊果酸和VC對(duì)DPPH·都具有明顯的清除能力。當(dāng)濃度從0.01 mg/mL上升至0.06 mg/mL時(shí),山茱萸熊果酸對(duì)DPPH·的清除率隨著濃度增加而逐漸增大;當(dāng)濃度大于0.06 mg/mL時(shí),茱萸熊果酸對(duì)DPPH·的清除率變化幅度較小,清除率與VC接近。當(dāng)山茱萸熊果酸的濃度為0.1 mg/mL時(shí),清除率最大為88.1%。

圖9 山茱萸熊果酸對(duì)DPPH·的清除能力Fig.9 Scavenging effects of ursolic acidfrom Cornus officinalis on DPPH·

2.3.3 山茱萸熊果酸對(duì)·OH清除能力 由圖10可知,山茱萸熊果酸對(duì)·OH具有明顯的清除能力。相同濃度下,山茱萸熊果酸對(duì)·OH的清除能力要小于VC。在0.01～0.04和0.06～0.1 mg/mL兩個(gè)濃度范圍內(nèi),山茱萸熊果酸對(duì)·OH的清除率與濃度基本呈線性關(guān)系變化。當(dāng)山茱萸熊果酸的濃度為 0.1 mg/mL時(shí),對(duì)·OH清除率最大為68.6%。

圖10 山茱萸熊果酸對(duì)·OH的清除能力Fig.10 Scavenging effects of ursolic acidfrom Cornus officinalis on hydroxyl

2.3.4 山茱萸熊果酸豬油抗氧化性試驗(yàn) 由圖11可知,山茱萸熊果酸和VC對(duì)豬油都有抗氧化作用。隨著山茱萸熊果酸使用量的增加,對(duì)豬油的抗氧化能力增強(qiáng);當(dāng)山茱萸熊果酸的添加量達(dá)到0.75%時(shí),對(duì)豬油的抗氧化能力,與添加濃度為0.25%的VC接近。

圖11 山茱萸熊果酸對(duì)豬油的抗氧化效果Fig.11 Antioxidant effect of ursolic acidfrom Cornus officinalis lard

綜上所述,在不同方法的抗氧化實(shí)驗(yàn)中,山茱萸熊果酸均體現(xiàn)出了抗氧化活性,由于山茱萸熊果酸對(duì)不同自由基的清除機(jī)制各有不同,其抗氧化指標(biāo)也表現(xiàn)不同。因此,需要結(jié)合多種方法來對(duì)其抗氧化能力進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

2.4 山茱萸抑菌活性實(shí)驗(yàn)

2.4.1 山茱萸中熊果酸對(duì)5種標(biāo)準(zhǔn)菌株藥敏試驗(yàn) 由表4可知,山茱萸熊果酸對(duì)食品領(lǐng)域常見的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、變形桿菌、枯草桿菌和黑曲霉菌均有抑制作用,對(duì)5種菌的抑菌能力大小為:大腸桿菌>金黃色葡萄球菌>枯草桿菌>變形桿菌>黑曲霉菌。

表4 山茱萸熊果酸抑菌直徑Table 4 Inhibitory zone diameters of ursolic acidfrom Cornus officinali against different microorganisms

2.4.2 山茱萸中熊果酸對(duì)各種試驗(yàn)菌株的MIC測(cè)定 由表5可見,對(duì)不同菌,山茱萸熊果酸達(dá)到一定濃度才顯示出抑菌活性。山茱萸熊果酸對(duì)大腸桿菌的MIC為6.25 mg/mL,對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草桿菌的MIC為12.5 mg/mL,對(duì)變形桿菌、黑曲霉菌的MIC為25 mg/mL。

表5 熊果酸對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC值Table 5 MIC of ursolic acid fromCornus officinalis against different strains

3 結(jié)論

采用單因素實(shí)驗(yàn),對(duì)各因素對(duì)熊果酸得率的影響趨勢(shì)進(jìn)行了研究,然后在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取出四種主要因素,通過設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化得到山茱萸中熊果酸提取的最佳工藝條件。結(jié)果表明:幾種因素對(duì)提取的影響大小排序?yàn)槌晻r(shí)間>超聲工作/間歇時(shí)間比>超聲功率>乙醇濃度,最佳的提取工藝條件為:提取時(shí)間25 min,乙醇濃度50%,超聲功率225 W,超聲工作/間歇時(shí)間比8 s/5 s,提取次數(shù)2次,溫度40 ℃,料液比1∶25 (g/mL)。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),測(cè)定平均得率可達(dá)13.16%。

山茱萸熊果酸具有明顯的抗氧化能力:山茱萸熊果酸對(duì)DPPH·和·OH都具有明顯的清除能力,0.04 mg/mL山茱萸熊果酸的還原能力與0.01 mg/mL的VC相當(dāng);濃度大于0.06 mg/mL時(shí),茱萸熊果酸對(duì)DPPH·的清除率與VC接近,當(dāng)濃度為 0.1 mg/mL時(shí),對(duì)DPPH·清除率最大為88.1%;在0.01～0.04和0.06～0.1 mg/mL兩個(gè)濃度范圍內(nèi),山茱萸熊果酸對(duì)·OH的清除率與濃度基本呈線性關(guān)系,當(dāng)濃度為 0.1 mg/mL時(shí),清除率最大為68.6%;山茱萸熊果酸對(duì)豬油有抗氧化作用,當(dāng)山茱萸熊果酸的添加量達(dá)到0.75%時(shí),對(duì)豬油的抗氧化能力,與添加濃度為0.25%的VC接近。

山茱萸熊果酸具有較強(qiáng)的抑菌作用,5種菌的抑菌能力大小為:大腸桿菌>金黃色葡萄球菌>枯草桿菌>變形桿菌>黑曲霉菌;對(duì)大腸桿菌的MIC為6.25 mg/mL,對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草桿菌的MIC為12.5 mg/mL,對(duì)變形桿菌、黑曲霉菌的MIC為 25 mg/mL。