孫華林,田奎蓉,賀夢(mèng)凡,方安才,黃小娥,扎西英派,劉俊林

(西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730030)

急性肝損傷可由短期大量攝入超出機(jī)體代謝能力的酒精而引起,造成肝臟微循環(huán)失調(diào)、肝細(xì)胞壞死、肝組織纖維化、肝硬化等,同時(shí)能介導(dǎo)肝癌的形成[1]。除此之外,酒精的大量攝入還能誘導(dǎo)低血糖、高血壓、高血脂等多種急性、慢性疾病的發(fā)生[2]。研究表明由于酒精作用下能阻止氧化型輔酶Ⅰ(NAD+)向還原型輔酶Ⅱ(NADPH)的轉(zhuǎn)化,引起糖異生異常導(dǎo)致機(jī)體脂肪代謝受阻,最終引起肝細(xì)胞甘油三酯(TG)大量沉積可導(dǎo)致酒精性脂肪肝(AFL)的形成。組織器官進(jìn)行大量乙醇氧化代謝還會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路的紊亂以及對(duì)蛋白轉(zhuǎn)錄異常[3],對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重傷害。據(jù)統(tǒng)計(jì),因急性肝損傷介導(dǎo)的酒精性肝病(ALD)在世界范圍內(nèi)發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì),約占全世界疾病導(dǎo)致死亡率的3.8%,發(fā)病人群以青年人居多[4]。ALD的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,在諸多研究成果中顯示,通過大量、連續(xù)的飲酒是導(dǎo)致該病的主要因素[5-6],而一次性或者短期大量飲酒導(dǎo)致的急性肝損傷是其主要的發(fā)病原因之一。

洛神花學(xué)名玫瑰茄(HibiscussabdariffaLinn.),在我國廣泛地區(qū)均有培植。洛神花成品多添加于各類花果茶與保健類食品中,經(jīng)沖泡過后,其色澤鮮亮,酸甜可口,帶有清新的果香,因而受到廣大消費(fèi)者歡迎。研究表明洛神花有利尿、清除氧自由基與加快脂肪代謝等作用[7],《傣醫(yī)藥》中記載洛神花:“清熱解渴,斂肺止咳”,具有降血壓、解酒的能力[8],此外洛神花對(duì)護(hù)腎、降血脂以及抗腫瘤[9-10]均有顯著效果。在前期研究中發(fā)現(xiàn)洛神花多糖提取物對(duì)大鼠急性肝損傷具有良好效果,因此本文選用洛神花多糖提取物對(duì)大鼠急性肝損傷模型進(jìn)行干預(yù),以確定相關(guān)劑量效應(yīng),分析其作用能力,并對(duì)其干預(yù)機(jī)制進(jìn)行探討,以期為洛神花多糖提取物作為良好天然解酒保健品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大鼠 200～250 g Wister大鼠120只，雌雄各半,由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(甘)2015-0001),其飼養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)及處死過程遵照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例和福利倫理指南執(zhí)行;ELISA試劑盒:谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒、堿性磷酸脂酶(ALP)試劑盒、膽堿酯酶(CHE)試劑盒 上海江萊生物科技有限公司;總蛋白(TP)試劑盒、白蛋白(ALB)試劑盒、球蛋白(GLB)試劑盒與谷胱甘肽(GSH)試劑盒 南京建成生物工程研究所;“紅星二鍋頭(56 °)”(500 mL/瓶) 北京紅星股份有限公司;“海王金樽”片(3 g×12) 杭州海王生物工程有限公司;其余試劑 均為國產(chǎn)分析純。

UV-1800紫外分光光度計(jì) 日本島津公司;N-1100D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海儀電儀器有限公司;Beckman Coulter AU680全自動(dòng)生化分析儀 美國貝克曼公司;Biotek多功能酶標(biāo)儀 美國博騰儀器有限公司;FD-1C-50真空冷凍干燥儀 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;3K30超速低溫離心機(jī) Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 洛神花多糖提取物制備 洛神花烘干粉碎后,按料液比1∶100 g/mL,80 ℃加入熱水浸提4 h后將提取液濃縮至原體積的1/3,按體積比1∶5 (V/V)加入80%乙醇,3000 r/min離心10 min,重復(fù)多次收集沉淀[11],得洛神花多糖粗提物,沉淀用蒸餾水溶解,活性炭脫色后,用Sevage試劑(正丁醇∶氯仿=4∶1,V/V)多次脫蛋白,取上清液,得洛神花多糖提取液[12],40～45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,真空冷凍干燥(-60 ℃)至恒重,得到淡紅色粉末,裝瓶密封于-20 ℃冰箱保存。并采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量[12],在490 nm處測(cè)定吸光度,以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,Y=0.0007x-0.0043(R=0.9758),測(cè)定所得提取物中洛神花多糖含量為67.21 mg/g。

1.2.2 急性肝損傷模型建立與治療過程 將 120 只 Wister 大鼠隨機(jī)分為 7 組,實(shí)驗(yàn)組、模型組和陽性對(duì)照組大鼠每只灌胃 17.5 mL/kg·d BW 的“紅星二鍋頭(56 °)”[10]持續(xù) 7 d,從各組中隨機(jī)抽取5只大鼠進(jìn)行病理檢查,觀察肝臟腫脹情況,即當(dāng)肝臟細(xì)胞邊界模糊,胞漿中充滿大小不等的脂肪空泡,少數(shù)細(xì)胞核被擠到一邊時(shí),確立模型建立[13]。實(shí)驗(yàn)組按照多糖濃度需求配成 1.0、2.0、4.0、8.0 g/kg BW 劑量(分別標(biāo)記為:1.0 g/kg洛神花組、2.0 g/kg洛神花組、4.0 g/kg洛神花組與8.0 g/kg洛神花組)的洛神花多糖提取物,對(duì)各組給予急性肝損傷大鼠進(jìn)行灌胃,陽對(duì)照組給予“海王金樽”10 mg/kg BW灌胃,模型組與正常組給予等量直飲水,持續(xù)治療7 d。

1.2.3 血液學(xué)檢測(cè)采用ELISA法測(cè)定 各組血清中ALT、AST、ALP與CHE的活力測(cè)定(均為雙抗夾心法),使用Beckman Coulter AU680全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中TP(雙縮脲法)、ALB(溴甲酚綠法)、GLB和GSH(分光光度法)含量,具體操作按照試劑盒測(cè)定說明書進(jìn)行。

1.2.4 大鼠體質(zhì)量變化 實(shí)驗(yàn)期間每天稱量大鼠體重,觀察大鼠在治療過程中的體重變化。

1.2.5 大鼠肝臟指數(shù)[14]解剖分離完整肝臟,稱量大鼠肝臟重量并肝臟指數(shù)計(jì)算公式:

1.2.6 大鼠肝臟組織切片的觀察 戊巴比妥皮下注射麻醉,頸動(dòng)脈采血[13]后立即處死,快速分離完整肝臟與胃部,進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察;將肝臟置于4%甲醛溶液中浸泡28 d,取浸泡完全的各組大鼠肝臟長、寬各1 cm左右,厚1 cm左右,水洗12 h以上后進(jìn)行梯度脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、烘片及HE染色等操作[15],觀察大鼠肝臟和胃部病變情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 血清中ALT、AST、ALP活力測(cè)定結(jié)果

如表1所示,模型組大鼠血清中ALT、AST與ALP活力與正常組相比均極顯著增高(P<0.01),說明造模成功;1.0～8.0 g/kg洛神花組ALT與模型組相比活力極顯著降低(P<0.01),其中2.0～8.0 g/kg洛神花組與正常組相比差異不顯著。2.0～8.0 g/kg洛神花組AST與模型組相比活力極顯著降低(P<0.01),1.0 g/kg洛神花組AST與模型組相比活力顯著降低(P<0.05),1.0～2.0 g/kg洛神花組與正常組相比均有極顯著差異(P<0.01),4.0～8.0 g/kg洛神花組AST與正常組相比活力均有顯著差異(P<0.05)。1.0～8.0 g/kg洛神花組ALP與模型組相比活力極顯著降低(P<0.01),其中1.0～8.0 g/kg洛神花組ALP與正常組相比活力有極顯著差異(P<0.01);陽性對(duì)照組ALT、AST、ALP較模型組活力均極顯著降低(P<0.01);洛神花多糖提取物在4.0 g/kg劑量下能極顯著降低急性肝損傷大鼠血清中的ALT、AST和ALP活力,與陽性對(duì)照組血清中各項(xiàng)指標(biāo)均十分接近,但對(duì)血清中ALP的調(diào)節(jié)效果與陽性對(duì)照組相比差異仍較大。當(dāng)肝臟細(xì)胞受損時(shí),細(xì)胞膜通透性增加,胞漿內(nèi)的ALT、AST和ALP釋放入血液中,在血清中活力大大升高,觀測(cè)其各項(xiàng)指標(biāo)變化可以綜合判定對(duì)肝臟損傷的調(diào)節(jié)效果[16];經(jīng)洛神花多糖提取物治療后血清中ALT、AST、ALP指標(biāo)活力下降,表示肝細(xì)胞損傷減少,肝臟實(shí)質(zhì)損害降低。

表1 血清中ALT、AST和ALP活力Table 1 ALT,AST and ALP activity in serum

2.2 血清中TP、ALB、GLB含量測(cè)定結(jié)果

如圖1所示,1.0～4.0 g/kg洛神花組血清中TP含量與模型組相比均顯著降低(P<0.05),陽性對(duì)照組血清中TP含量與正常組相比,顯著升高(P<0.05),1.0、4.0 g/kg洛神花組血清中TP含量與正常組相比具有顯著降低(P<0.05);陽性對(duì)照組血清中ALB與正常組相比,顯著升高(P<0.05),1.0、4.0 g/kg洛神花組血清中ALB與正常組相比,顯著降低(P<0.05)。當(dāng)肝損傷時(shí)肝功能會(huì)受到影響,血清中TP和GLB會(huì)有一定程度升高[17]。而模型組急性的肝損傷時(shí),GLB和ALB并未明顯升高,考慮是腎臟可能出現(xiàn)了部分蛋白質(zhì)丟失造成,洛神花多糖提取物能在一定程度上改善急性肝損傷大鼠血清中的GLB和ALB升高的情況。

圖1 血清中蛋白含量Fig.1 Serum protein content注:#與正常組相比具有顯著性(P<0.05);##與正常組相比具有極顯著性差異(P<0.01);*與模型組相比具有顯著性差異(P<0.05),**與模型組相比具有極顯著性差異(P<0.01),圖2～圖3、圖5同。

2.3 血清中CHE活力測(cè)定結(jié)果

如圖2所示,模型組CHE活力與正常組相比極顯著降低(P<0.01);4.0～8.0 g/kg洛神花組CHE活力與模型組相比顯著增高(P<0.05),陽性對(duì)照組血清中CHE活力與模型組相比極顯著增高(P<0.01);1.0 g/kg洛神花組CHE活力與正常組相比顯著降低(P<0.05)。肝臟實(shí)質(zhì)性細(xì)胞損傷時(shí)血清中CHE活力會(huì)明顯下降[18],在洛神花4.0和8.0 g/kg作用下血清中CHE活力有所增高,接近于正常組水平,說明在洛神花多糖的作用下肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷有所減少。

圖2 血清中CHE活力變化結(jié)果Fig.2 Changes of CHE activity in serum

2.4 血清中GSH含量測(cè)定結(jié)果

如圖3所示,與正常組相比,模型組GSH含量極顯著降低(P<0.01),1.0 g/kg洛神花組GSH含量顯著降低(P<0.05),其余組均無顯著性差異。陽性對(duì)照組、4.0～8.0 g/kg洛神花組GSH含量與模型組相比極顯著增高(P<0.01),1.0與2.0 g/kg洛神花組GSH含量與模型組相比顯著增高(P<0.05);GSH大量存在于肝臟中,具有消除氧自由基對(duì)臟器損害的能力[19],當(dāng)肝細(xì)胞抵抗酒精損傷時(shí)會(huì)大量消耗GSH,導(dǎo)致合成釋放入血的GSH含量降低,因此檢測(cè)血清中GSH能反應(yīng)肝臟GSH消耗情況,血清中GSH消耗減少,表明肝臟細(xì)胞損傷有所降低,在洛神花多糖提取物作用下能減輕肝臟GSH的過度耗竭。

圖3 血清中GSH含量Fig.3 GSH content in serum

2.5 大鼠體質(zhì)量變化情況

如圖4所示,在4.0 g/kg洛神花治療下大鼠體重降低減少情況表現(xiàn)較為明顯。其體重隨治療時(shí)間增加,但與陽性對(duì)照組體重變化差異不明顯,模型組體重隨治療時(shí)間增加而有所降低,且隨時(shí)間增加有繼續(xù)下降趨勢(shì),4.0 g/kg洛神花組在治療過程中體重降低有所減少。正常組體重不斷增加。

圖4 大鼠體質(zhì)量改變情況Fig.4 Changes in body weight of rats

2.6 大鼠肝臟指數(shù)

如圖5所示,與正常組相比,模型組肝臟指數(shù)極顯著增高(P<0.01),表明肝臟受損嚴(yán)重,肝體腫脹明顯;且除1.0 g/kg洛神花組肝臟指數(shù)顯著增高(P<0.05)外,其余組均無顯著性差異;陽性對(duì)照組、1.0～8.0 g/kg洛神花組肝臟指數(shù)與模型組相比均有極顯著降低(P<0.01)。并且4.0、8.0 g/kg洛神花組大鼠肝臟指數(shù)降低最為明顯。肝臟指數(shù)是衡量肝臟腫脹的指標(biāo),洛神花治療各組與模型組相比肝臟指數(shù)有所下降,洛神花各劑量組肝體增大腫脹情況不明顯,表明肝臟充血水腫有所消退,肝臟局部微循環(huán)有所改善。

圖5 大鼠肝臟指數(shù)變化Fig.5 Changes of liver index in rat

2.7 大鼠肝臟與胃部病變情況

如圖6所示，A-1、A-2、B-1、B-2、C-1、C-2中所見,急性肝損傷大鼠經(jīng)洛神花多糖提取物干預(yù)后,肝葉邊緣鈍圓情況減輕,肝體充血水腫消退,被膜緊張情況減弱,肝臟體積有所減少。

如圖6中A-3、B-3、C-3所見，急性肝損傷大鼠經(jīng)洛神花多糖干預(yù)后,胃黏膜組織破損情況減輕,有腺區(qū)與無腺區(qū)分界清晰,胃黏膜潮紅情況有所改善,胃黏膜表面出血情況基本消失。

圖6 大鼠肝臟病變與胃部組織潰瘍情況Fig.6 Rat liver lesions and gastric tissue ulcers注:A-1為模型組肝臟正面圖;A-2為模型組肝臟背面圖;A-3為模型組胃內(nèi)表面圖;B-1為4.0 g/kg洛神花多糖提取物治療組肝臟正面圖;B-2為4.0 g/kg洛神花多糖提取物治療組肝臟背面圖;B-3為4.0 g/kg洛神花多糖提取物治療組胃內(nèi)表面圖;C-1正常組肝臟正面圖;C-2為正常組肝臟背面圖;C-3為正常組胃內(nèi)表面圖。

在洛神花多糖提取物治療下肝體腫脹消退,充血情況減輕,說明洛神花多糖提取物能有效降低肝臟充血水腫的情況;同時(shí),胃黏膜潮紅消退,黏膜出血情況消失,說明局部潰瘍癥狀有所減輕;可見在洛神花多糖提取物治療下,能有效緩解肝臟充血水腫和降低胃黏膜充血、潮紅、潰瘍的情況。

2.8 大鼠肝臟組織切片觀察結(jié)果

如圖7所示,經(jīng)洛神花多糖提取物干預(yù)后,肝細(xì)胞腫脹減退,肝竇中無紅細(xì)胞存在,門管區(qū)周圍僅有輕微炎性細(xì)胞浸潤,肝細(xì)胞索排列較為清晰?？梢娫诼迳窕ǘ嗵翘崛∥镒饔孟?肝臟出血、水腫以及肝細(xì)胞變性壞死和炎性細(xì)胞浸潤情況有所改善,肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)趨于正常,洛神花多糖提取物對(duì)急性肝損傷引起的肝臟組織學(xué)病變有良好的干預(yù)作用,能夠改善局部微環(huán)境、增加局部吸收和減少炎性浸潤,以保護(hù)肝臟免受損傷。

圖7 大鼠肝臟組織切片F(xiàn)ig.7 Tissue section of rat liver注:A、a為正常組大鼠肝臟切片(HE,100×;200×);B、b為模型組大鼠肝臟切片(HE,100×;200×);C、c為洛神花多糖提取物4.0 g/kg治療組大鼠肝臟切片(HE,100×;200×);D、d為陽性對(duì)照組大鼠肝臟切片(HE,100×;200×)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以洛神花多糖提取物作為研究對(duì)象,針對(duì)其多糖提取物質(zhì)對(duì)ALD的干預(yù)治療作用,測(cè)定各組血清中ALT、AST、ALP、CHE活力及TP、ALB、GLB、GSH含量變化;計(jì)算肝臟指數(shù),體質(zhì)量變化情況,結(jié)合肝臟與胃部黏膜形態(tài)學(xué)觀察與肝臟組織石蠟病理切片觀察綜合分析。結(jié)果顯示:在形態(tài)學(xué)和組織學(xué)觀察所見洛神花多糖提取物能能有效減輕肝體充血腫脹和降低胃黏膜破潰情況,同時(shí)保護(hù)肝臟免受因酒精過量攝入而導(dǎo)致的肝臟細(xì)胞腫脹變性壞死,減輕局部炎性細(xì)胞浸潤和肝臟出血情況。洛神花多糖提取物對(duì)急性肝損傷大鼠肝臟病變進(jìn)程具有一定延緩作用,能有效減輕胃黏膜破潰情況,并且存在一定劑量關(guān)系,其中,以4.0 g/kg洛神花多糖治療效果最佳。洛神花多糖干預(yù)下與模型組相比能有效降低血清中ALT、AST、ALP活力(P<0.01),延緩肝硬化進(jìn)程。同時(shí)能增強(qiáng)血清中CHE活力(P<0.05),改善血液中GSH過度耗竭(P<0.01)的情況,減輕乙醇氧化代謝對(duì)肝臟和機(jī)體的損傷。洛神花多糖提取物對(duì)急性肝損傷大鼠具有良好的干預(yù)治療作用和保肝能力,具有良好開發(fā)應(yīng)用潛力。