何鴻舉,蔣圣啟,王 魏,王玉玲,馬漢軍,2,陳復(fù)生,朱明明,趙圣明,周浩宇

(1.河南科技學(xué)院食品學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003;2.河南科技學(xué)院博士后研發(fā)基地,河南新鄉(xiāng) 453003;3.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院,河南鄭州 450001;4.河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003)

作為禽肉重要組成的雞肉,因其脂肪和膽固醇含量低、蛋白質(zhì)含量高且價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)成為國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者青睞的對(duì)象[1-3]。微生物指標(biāo)直接反映了冷鮮雞肉品質(zhì)好壞和腐敗程度。冷鮮雞肉在運(yùn)輸、保藏和加工過(guò)程中,都會(huì)因?yàn)槲⑸锏纳L(zhǎng)和繁殖導(dǎo)致品質(zhì)下降[4]。乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是一群可以發(fā)酵糖類,并產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽(yáng)性桿菌或球菌,廣泛存在于人、畜、禽的腸道以及許多食品、物料中[5-6]。冷鮮肉在冷藏過(guò)程中的腐敗變質(zhì)主要是由于嗜冷性微生物的大量增殖代謝造成的,乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖加速了冷鮮肉的腐敗變質(zhì)[7-8]。孫彥雨[9]研究發(fā)現(xiàn),乳酸菌是真空冷鮮雞胸肉的優(yōu)勢(shì)腐敗菌之一,會(huì)分解雞肉中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生有機(jī)酸,使雞肉pH下降,感官品質(zhì)下降。梁慧等[10]發(fā)現(xiàn)乳酸菌是冷鮮雞肉初始菌相中占比最大的菌群,達(dá)到35%。賴宏剛等[11]對(duì)冷鮮雞肉中腐敗微生物進(jìn)行分離鑒定,結(jié)果表明乳酸菌是冷鮮雞肉中主要腐敗菌群之一。

傳統(tǒng)檢測(cè)乳酸菌的方法有平板法、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物法和凝膠電泳檢測(cè)法等[12-14]。雖然這些方法結(jié)果準(zhǔn)確可靠,但存在費(fèi)時(shí)費(fèi)力,消耗大量藥品,以及對(duì)原有樣品造成破壞性等缺點(diǎn)。這些傳統(tǒng)方法已經(jīng)無(wú)法滿足現(xiàn)場(chǎng)快速分析檢測(cè)和工業(yè)化實(shí)時(shí)在線檢查的要求。此外,這些傳統(tǒng)技術(shù)也不適用于測(cè)量大量樣品的場(chǎng)合。因此,需要開(kāi)發(fā)快速檢測(cè)乳酸菌的相關(guān)方法和技術(shù)來(lái)滿足生產(chǎn)者和消費(fèi)者對(duì)乳酸菌快速無(wú)損檢測(cè)的需求。

高光譜技術(shù)(Hyperspectral imaging,HSI)將光譜和成像結(jié)合起來(lái),可同時(shí)獲得樣品的光譜信息和圖像信息[15],該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于肉類無(wú)損檢測(cè)的各個(gè)領(lǐng)域。Barbin等[16]通過(guò)高光譜技術(shù)對(duì)雞胸肉的持水力、色澤L*和pH進(jìn)行建模預(yù)測(cè),其預(yù)測(cè)模型的相關(guān)系數(shù)0.84、0.95和0.9;Yang等[17]用400～2500 nm的HSI對(duì)雞肉進(jìn)行等級(jí)分類,其模型相關(guān)系數(shù)達(dá)到了0.85。王莉等[18]針對(duì)灘羊肉的菌落總數(shù)和揮發(fā)性鹽基氮進(jìn)行400～1000 nm HSI的建模分析,得到預(yù)測(cè)模型的相關(guān)系數(shù)分別為0.87和0.88;王慧等[19]對(duì)雞肉嫩度的高光譜數(shù)據(jù)分析建模,最終獲得最優(yōu)預(yù)測(cè)模型R為0.94,效果較好。目前,已報(bào)到的肉類乳酸菌無(wú)損檢測(cè)研究較少,大多數(shù)見(jiàn)于近紅外光譜技術(shù)領(lǐng)域。光譜技術(shù)只能夠提供被測(cè)樣品的光譜信息,其不足之處是不能反應(yīng)樣本的空間分布信息,且結(jié)合高光譜技術(shù)對(duì)雞胸肉的乳酸菌含量進(jìn)行無(wú)算檢測(cè)的研究鮮有報(bào)道。

本試驗(yàn)基于高光譜成像技術(shù)的優(yōu)勢(shì),通過(guò)分析波長(zhǎng)900～1700 nm高光譜數(shù)據(jù),構(gòu)建快速穩(wěn)定預(yù)測(cè)模型,旨在實(shí)現(xiàn)對(duì)冷鮮雞肉中乳酸菌的無(wú)接觸快速檢測(cè)。為建立一種快速無(wú)損檢測(cè)雞肉中乳酸菌方法和雞肉品質(zhì)在線監(jiān)測(cè)設(shè)備的開(kāi)發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷鮮雞胸肉 河南眾品股份有限公司;CM361乳酸菌培養(yǎng)基、CM0509蛋白胨 英國(guó)Oxoid公司;氯化鈉 分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

HSI-eNIR-XC130型推掃式高光譜成像設(shè)備 臺(tái)灣Isuzu Optics公司;3900-ER光源 美國(guó)Illumination Technologies公司;ImSpector V10E光譜儀 芬蘭Spectral Imaging公司;CCD探測(cè)儀 愛(ài)爾蘭Andor公司;OLE2鏡頭 德國(guó) Schneider公司;移動(dòng)平臺(tái) 中國(guó)Isuzu Optics公司;SW-CJ-1D雙人單面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;HV-85全自動(dòng)高壓滅菌鍋 日本Hirayama公司;BF240微生物培養(yǎng)箱 德國(guó)Binder公司;Scientz-04拍打式均質(zhì)機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 冷鮮雞胸肉預(yù)處理 將新鮮的雞胸肉置于帶冰袋的無(wú)菌冷藏箱內(nèi),運(yùn)至微生物實(shí)驗(yàn)室。分割樣品前將案板和刀具放入超凈工作臺(tái)中開(kāi)紫外光燈滅菌30 min。把整塊雞胸肉在超凈工作臺(tái)中分割成3.0 cm(長(zhǎng)度)× 3.0 cm(寬度)× 1.0 cm(厚度)的小塊,共獲得119塊樣品;用一次性塑料盒將樣品分裝編號(hào),置于0～4 ℃的冰箱內(nèi),每24 h取出若干樣本,進(jìn)行高光譜數(shù)據(jù)的采集和肉樣中乳酸菌的測(cè)定。最長(zhǎng)儲(chǔ)存時(shí)間為7 d。

1.2.2 高光譜數(shù)據(jù)采集 將高光譜成像設(shè)備打開(kāi)預(yù)熱30 min使其光源穩(wěn)定,減少光譜設(shè)備不穩(wěn)定帶來(lái)的誤差。將待測(cè)樣品從0～4 ℃冰箱中取出,待其溫度恢復(fù)至室溫。然后將樣品置于設(shè)備載物臺(tái)上掃描樣品高光譜圖像,基于本實(shí)驗(yàn)室前期和Wang等[20]研究成果,高光譜設(shè)備參數(shù)設(shè)置如表1所示。相機(jī)自身暗電流會(huì)使樣品圖像采集過(guò)程有附帶很多噪聲信息,需對(duì)原始圖像進(jìn)行黑白校正,減少部分噪聲對(duì)高光譜數(shù)據(jù)的影響,具體校正方法和公式參考He等[21]研究。

表1 高光譜成像設(shè)備參數(shù)設(shè)置Table 1 Parameters setting of hyperspectral imaging system

1.2.3 乳酸菌測(cè)定 樣品采集完高光譜圖像之后,根據(jù)GB 4789.35-2016 《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》的要求進(jìn)行檢測(cè)乳酸菌菌落總數(shù)[22]。

1.2.4 光譜數(shù)據(jù)提取及預(yù)處理 通過(guò)HSI Analyzer軟件校正高光譜圖像,提取圖像中感興趣區(qū)(Region of interest,ROI)內(nèi)的每個(gè)像素點(diǎn)的光譜信息,計(jì)算所有像素點(diǎn)光譜信息的平均值。獲得的原始光譜會(huì)附帶外在的干擾和噪聲信息,影響樣品數(shù)據(jù)的真實(shí)性,因此需要對(duì)原始光譜進(jìn)行預(yù)處理來(lái)消除或減弱外界光線和噪聲等因素對(duì)真實(shí)數(shù)據(jù)的影響[23]。數(shù)據(jù)采用多元散射校正(Multiplicative Scatter Correction,MSC)、基線校正法(Baseline Correction,BC)、移動(dòng)平均平滑(Moving Average Smoothing,MAS)、標(biāo)準(zhǔn)變量變換(Standard Normalized Variate,SNV)、歸一化法(Normalize,NOR)、中值濾波平滑(Median Filter Smoothing,MFS)、卷積平滑(Savitzky Golay Smoothing,SG)和高斯濾波平滑(Gaussian Filter Smoothing,GFS)預(yù)處理原始光譜數(shù)據(jù),對(duì)比每一種預(yù)處理效果,獲取最佳預(yù)處理方法[24-26]。

1.2.5 預(yù)測(cè)模型構(gòu)建、評(píng)價(jià)及優(yōu)化

1.2.5.1 偏最小二乘模型構(gòu)建及評(píng)價(jià) 偏最小二乘(Partial Least Squares,PLS)是一種高效率多元數(shù)據(jù)分析方法,融合了多元線性回歸(Multiple Linear Regression,MLR)和主成分回歸法(Principal Component Regression,PCR)的功能,具有適用范圍廣和預(yù)測(cè)能力強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)[27-28]。本試驗(yàn)將900～1700 nm波長(zhǎng)的反射率作為自變量,乳酸菌參考值作為因變量,通過(guò)PLS回歸,構(gòu)建預(yù)測(cè)雞肉中乳酸菌含量的PLS模型。模型的性能通過(guò)相關(guān)系數(shù)(r)、校正誤差(Root Mean Square Error of Calibration,RMSEC)、內(nèi)部交叉驗(yàn)證均方根誤差(Root Mean Square Error of Cross Validation,RMSECV)和外部預(yù)測(cè)均方根誤差(Root Mean Square Error of Prediction,RMSEP)的數(shù)值大小來(lái)衡量。r越接近1,RMSE值越小,模型的精度越高,預(yù)測(cè)效果越好[29]。魯棒性和剩余預(yù)測(cè)偏差(Residual Predictive Deviation,RPD)也可以評(píng)價(jià)模型的性能。魯棒性是通過(guò)(RMSEC-RMSEP(表示,(RMSEC-RMSEP(的值越小,模型越穩(wěn)定[30]。RPD是預(yù)測(cè)集所有樣本參考值的標(biāo)準(zhǔn)偏差和預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)偏差的比值,參考Malley等[31]的RPD反映效果表,RPD在1.75～2.25,反映模型是比較有用的;RPD在2.25～3,反映模型是比較成功的;RPD在3～4,反映模型是成功的;RPD大于4,反應(yīng)模型是優(yōu)秀的。以上評(píng)價(jià)參數(shù)指標(biāo)按式(1)～(4)計(jì)算:

式(1)

式(2)

式(3)

式(4)

1.2.5.2 模型優(yōu)化 本試驗(yàn)采用的900～1700 nm范圍內(nèi)共有486個(gè)波長(zhǎng)。采用全部波長(zhǎng)作為建模的輸入變量,可以達(dá)到較好地的預(yù)測(cè)效果,但全波段數(shù)據(jù)量龐大且含有較多冗余信息,會(huì)降低模型運(yùn)算效率,影響模型預(yù)測(cè)能力。雖然采用不同的預(yù)處理方法處理原始數(shù)據(jù)可以去除系統(tǒng)噪聲的影響,但預(yù)處理不能消除冗余信息、并保留對(duì)乳酸菌含量模型貢獻(xiàn)的有用信息。因此需要將與乳酸菌含量關(guān)系最大的最優(yōu)波長(zhǎng)從全波段中篩選出來(lái)進(jìn)行建模,剔除無(wú)關(guān)信息,提取有用信息,減少數(shù)據(jù)計(jì)算量,提高建模效率和預(yù)測(cè)精度。

本試驗(yàn)采用回歸系數(shù)法(Regression Coefficient,RC)[32]、逐步回歸法(Stepwise)[33]和連續(xù)投影算法(Successive Projections Algorithm,SPA)[34]篩選最優(yōu)波長(zhǎng)。這三種方法被廣泛應(yīng)用于光譜模型變量選擇上,可以在建模過(guò)程中篩選有用變量、剔除不相關(guān)變量達(dá)到變量降維的效果,從而減少原始光譜數(shù)據(jù)的奇異性的和不穩(wěn)定性。通過(guò)比較三種化學(xué)計(jì)量學(xué)算法篩選出最優(yōu)波長(zhǎng)的數(shù)量、波長(zhǎng)減少量以及優(yōu)化后模型的性能,挑選出最好的篩選乳酸菌特征波長(zhǎng)的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)整理:每個(gè)樣品的乳酸菌含量參考值對(duì)應(yīng)每個(gè)樣本的光譜信息,在Excel 2010軟件中整理。

數(shù)據(jù)分集:將所有樣本按乳酸菌含量參考值從小到大排列,隨機(jī)取出樣本總數(shù)的三分之二作為校正集,剩下三分之一作為預(yù)測(cè)集。

全波段模型構(gòu)建:將樣本的光譜信息作為自變量x,乳酸菌含量參考值作為因變量y。通過(guò)The Unscrambler 9.7建模軟件建立全波段偏最小二乘預(yù)測(cè)模型。

最優(yōu)波長(zhǎng)篩選:SPA法是在MATLAB R2006a程序開(kāi)發(fā)軟件的工作區(qū)域中輸入樣本的光譜信息Xc,乳酸菌含量參考值Yc。然后輸入SPA的程序相關(guān)指令,通過(guò)軟件計(jì)算得到相應(yīng)的最優(yōu)波長(zhǎng)。中Stepwise法是在MATLAB R2006a程序開(kāi)發(fā)軟件的工作區(qū)域中輸入樣本的光譜信息Xc,乳酸菌含量參考值Yc。然后輸入Stepwise的程序相關(guān)指令,通過(guò)軟件計(jì)算得到相應(yīng)的最優(yōu)波長(zhǎng)。RC法在軟件Unscrambler 9.7中通過(guò)挑選在全波段模型建立中回歸系數(shù)最大的波長(zhǎng),即為最優(yōu)波長(zhǎng)。

模型優(yōu)化:將樣本的最優(yōu)波長(zhǎng)光譜信息作為自變量x,乳酸菌含量參考值作為因變量y。通過(guò)The Unscrambler 9.7建模軟件建立優(yōu)化的偏最小二乘預(yù)測(cè)模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌測(cè)量結(jié)果

本試驗(yàn)共獲得119個(gè)乳酸菌菌落總數(shù)參考值,按照1.3取其中40個(gè)作為預(yù)測(cè)集樣品,其余的79個(gè)作為校正集樣品,對(duì)應(yīng)的光譜數(shù)據(jù)按同樣的方式分組。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2所示。

冷鮮雞胸肉0～4 ℃儲(chǔ)藏7 d的乳酸菌含量變化,如圖1所示。該試驗(yàn)的初始乳酸菌為2.55lg CFU/g,隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng),在1～5 d內(nèi)乳酸菌快速生長(zhǎng),5～7 d生長(zhǎng)趨于緩慢。雞胸肉的品質(zhì)在1～2 d內(nèi)正常,無(wú)明顯變質(zhì)現(xiàn)象;在3～4 d內(nèi)黏度開(kāi)始增加,彈性下降,開(kāi)始出現(xiàn)腐敗氣味,感官品質(zhì)明顯變差;在5～6 d內(nèi)雞胸肉的顏色變暗,出現(xiàn)乳黃色崩解液體;第7 d的乳酸菌數(shù)量達(dá)到7.50lg CFU/g,雞肉已經(jīng)完全發(fā)臭腐敗[35]?？赡苡捎趧傞_(kāi)始冷鮮雞胸肉營(yíng)養(yǎng)豐富適合乳酸菌的生長(zhǎng),腐敗微生物的總數(shù)較少,菌種之間的競(jìng)爭(zhēng)作用較小,導(dǎo)致乳酸菌在前5 d快速生長(zhǎng)。隨著乳酸菌和其他腐敗微生物的共同增殖,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的慢慢耗盡,比例失調(diào)導(dǎo)致環(huán)境條件越來(lái)越不適宜乳酸菌的生長(zhǎng),衰亡的細(xì)胞數(shù)增多,導(dǎo)致在最后2 d生長(zhǎng)速度變慢[36]。

圖1 冷鮮雞肉儲(chǔ)藏期內(nèi)乳酸菌含量變化Fig.1 Change of lactic acid bacteria contents infresh chicken breast during storage period

2.2 冷鮮雞胸肉的光譜特征

圖2整體上反映119個(gè)樣品的光譜曲線高低位置不同,但趨勢(shì)一致,說(shuō)明肉樣的化學(xué)成分含量不同。雖然光譜上找不到明顯的乳酸菌吸收峰,但是乳酸菌的生長(zhǎng)離不開(kāi)雞肉中的各種化學(xué)組分,可以通過(guò)化學(xué)計(jì)量學(xué)手段挖掘光譜信息,尋找到特征光譜信息與乳酸菌之間的定量關(guān)系。圖2顯示不同預(yù)處理之后雞肉樣品光譜和原始光譜在形狀上有不同的變化,這表明每種預(yù)處理消除噪聲的方法和消除效果不同。

圖2 不同預(yù)處理下的雞肉樣品近紅外光譜特征Fig.2 NIR characteristics of chicken samples under different pretreatment注:(a)原始光譜;(b)NOR預(yù)處理光譜;(c)MAS預(yù)處理光譜;(d)SNV預(yù)處理光譜;(e)SG預(yù)處理光譜;(f)MSC預(yù)處理光譜;(g)MFS預(yù)處理光譜;(h)BC預(yù)處理光譜;(i)GFS預(yù)處理光譜。

2.3 基于全波段光譜預(yù)測(cè)乳酸菌

本試驗(yàn)采用PLS回歸算法挖掘雞胸肉中乳酸菌參考值與全波段光譜信息之間的相關(guān)性,即建立F-PLS回歸模型,結(jié)果如表3所示。

表3 F-PLS模型預(yù)測(cè)雞胸肉中乳酸菌含量結(jié)果Table 3 Results of predicting lactic acid bacteria by F-PLS model in chicken breast

由表3得知,利用原始光譜和預(yù)處理光譜構(gòu)建的9種F-PLS回歸模型預(yù)測(cè)冷鮮雞胸肉中乳酸菌含量效果良好。rC都達(dá)到了0.963以上,rP達(dá)到了0.913以上,模型精度都較高;ΔE均在0.200以下,模型穩(wěn)定性較好;RPD在2.3～3.2之內(nèi),模型建立都比較成功。但每種預(yù)處理光譜所建立的F-PLS精度、穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)能力有各有不同。通過(guò)8種預(yù)處理光譜所建F-PLS模型的各種參數(shù)與原始光譜所建F-PLS模型進(jìn)行對(duì)比,SG預(yù)處理光譜的RPD最大,為3.121,參考Malley等[31]的RPD反映效果表,說(shuō)明該模型是成功的。且rC為0.981,rCV為0.936,rP為0.950,模型的相關(guān)性較好,預(yù)測(cè)能力較強(qiáng);ΔE為0.152,維持在較低水平,模型的魯棒性較好,性能穩(wěn)定。SG預(yù)處理光譜所建F-PLS模型為最佳模型。

2.4 最優(yōu)波長(zhǎng)篩選結(jié)果

以SG預(yù)處理光譜和SG預(yù)處理光譜構(gòu)建的F-PLS模型為基礎(chǔ),采用RC、Stepwise和SPA算法從486個(gè)波長(zhǎng)中篩選最優(yōu)波長(zhǎng)優(yōu)化F-PLS回歸模型。結(jié)果如表4所示:三種篩選方法選出的最優(yōu)波長(zhǎng)數(shù)都在20～30之間,波長(zhǎng)減少量在94%～96%之間。用Stepwise法篩選出來(lái)的最優(yōu)波長(zhǎng)數(shù)量最少為20個(gè),與SPA篩選出的21個(gè)數(shù)量接近。相比較486個(gè)全波長(zhǎng)數(shù),RC法、Stepwise法和SPA法篩選出的最優(yōu)波長(zhǎng)數(shù)量分別減少了94.86%、95.88%和95.68%。SPA法篩選的波長(zhǎng)具體位置如圖3所示。在SPA法篩選最優(yōu)波長(zhǎng)位置圖3中,篩選對(duì)象是900～1700 nm的486個(gè)波長(zhǎng),紅色方塊標(biāo)識(shí)的位置即為最優(yōu)波長(zhǎng)所在位置,共21個(gè)。

表4 三種方法篩選最優(yōu)波長(zhǎng)結(jié)果比較Table 4 Comparison of optimal wavelengths selected by three methods

圖3 SPA法篩選的最優(yōu)波長(zhǎng)位置圖Fig.3 Optimal wavelength location selected by SPA

2.5 基于最優(yōu)波長(zhǎng)預(yù)測(cè)乳酸菌

利用三種方法篩選出的最優(yōu)波長(zhǎng),分別建立優(yōu)化模型,結(jié)果如表5所示。

表5 優(yōu)化PLS模型預(yù)測(cè)雞胸肉中乳酸菌含量結(jié)果Table 5 Results of predicting lactic acid bacteria by optimized PLS model in chicken breast

由表5可得,與全波段F-PLS回歸模型相比較,優(yōu)化后的PLS模型相關(guān)系數(shù)整體上都有所降低,誤差也都有增加。其中用Stepwise法篩選出的20最優(yōu)波長(zhǎng),雖然波長(zhǎng)數(shù)量最少,但所構(gòu)建的SW-PLS模型效果不理想?；赗C和SPA構(gòu)建的RC-PLS模型和SPA-PLS模型相比,后者使用的波長(zhǎng)數(shù)最少,RPD最大,為2.787,rP最大,為0.949,ΔE最小,為0.135lg CFU/g。說(shuō)明基于SPA法篩選出的21個(gè)最優(yōu)波長(zhǎng)建立的SPA-PLS模型精度最高,預(yù)測(cè)穩(wěn)定性最好。

3 結(jié)論

對(duì)近紅外高光譜數(shù)據(jù)對(duì)冷鮮雞胸肉的乳酸菌含量進(jìn)行快速無(wú)接觸檢測(cè),采用MSC等8種不同方法預(yù)處理原始光譜后,分別構(gòu)建全波段F-PLS模型預(yù)測(cè)雞肉乳酸菌,其中基于SG預(yù)處理光譜所構(gòu)建的F-PLS模型效果最好。使用RC、Stepwise和SPA篩選最優(yōu)波長(zhǎng),其中通過(guò)SPA篩選的21個(gè)最優(yōu)波長(zhǎng)建立的SPA-PLS模型預(yù)測(cè)效果最好,rP達(dá)到0.949,RMSEP為0.439lg CFU/g。結(jié)果表明,采用合適的化學(xué)計(jì)量學(xué)算法挖掘近紅外高光譜數(shù)據(jù)構(gòu)建模型快速無(wú)接觸檢測(cè)冷鮮雞肉中乳酸菌是可行的。