莫一凡,姚凌云,馮 濤,宋詩(shī)清,孫 敏

(上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精技術(shù)與工程學(xué)院,上海 201418)

無(wú)花果(FicuscaricaL.)桑科榕屬,其新鮮果實(shí)極易腐敗,因而被加工為粉、粒、糕等[1]。研究表明,無(wú)花果在抗癌、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗菌、治療白癜風(fēng)等方面有顯著作用[2]?？寡趸饔玫奶骄恳恢币詠?lái)是醫(yī)學(xué)研究的重要環(huán)節(jié)[3]。黃酮類物質(zhì)是一種母核結(jié)構(gòu)為2-苯基色原酮的多酚類化合物，多以糖苷的形式存在[4-5],它具有高度的化學(xué)反應(yīng)性能,能夠清除生物機(jī)體內(nèi)的自由基,具有良好的抗氧化功效[6-7],不同品種無(wú)花果中均有定量的黃酮。

本研究以新疆無(wú)花果干為原料,對(duì)其總黃酮進(jìn)行了提取并且通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化最佳提取工藝,隨后將無(wú)花果總黃酮與抗壞血酸的抗氧化活性進(jìn)行了對(duì)比分析，為無(wú)花果干總黃酮在功能性食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

無(wú)花果干 新疆比巴哈農(nóng)牧科技有限公司;無(wú)水乙醇、NaNO2、Al(NO3)·9H2O、水楊酸、FeSO4、H2O2、NaCl、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、KCl、NaOH、鹽酸、鄰苯三酚、叔丁基對(duì)苯二酚、三羥甲基氨基甲烷、抗壞血酸 分析純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;蘆丁標(biāo)品 純度>98%,上海源葉生物科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS) 分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

FA1604型電子天平 上海天平儀器廠;JHBE-60T型閃式高速提取器 上海釩幟精密設(shè)備有限公司;SUS304型科滿仕高速多功能粉碎機(jī) 永康市鉑歐五金制品有限公司;UV2350型紫外可見分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司;DHG-9140型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海-恒科學(xué)儀器有限公司;SK5200BT型超聲清洗器 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司;FE20-Plus型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 無(wú)花果總黃酮的提取工藝 方法參考文獻(xiàn)[19]并做適當(dāng)修改,無(wú)花果干粉碎過(guò)60目篩,精確稱取無(wú)花果粉末(1.000±0.001) g按一定液料比加入一定體積分?jǐn)?shù)乙醇作為提取溶劑,在設(shè)定電壓下,在閃式提取器中提取一定時(shí)間,離心(4 ℃,10000 r/min,10 min)、過(guò)濾,將所得溶液用50%乙醇定容于70 mL即可得到提取物原液,最終將提取原液放置冰箱4 ℃冷藏保存。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)無(wú)花果總黃酮提取的影響 固定提取電壓150 V,提取時(shí)間為60 s,料液比為50∶1 mL/g,考察乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為40%,50%,60%,70%,80%時(shí)對(duì)無(wú)花果總黃酮提取量的影響,確定適宜的乙醇體積分?jǐn)?shù)。

1.2.2.2 電壓對(duì)無(wú)花果總黃酮提取的影響 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%,提取時(shí)間為60 s,液料比為50∶1 mL/g,考察提取電壓分別為75、100、125、150、175 V對(duì)無(wú)花果總黃酮提取量的影響,確定適宜的提取電壓。

1.2.2.3 時(shí)間對(duì)無(wú)花果總黃酮提取的影響 固定提取電壓為150 V,固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%,液料比為50∶1 mL/g,考察提取時(shí)間分別為20、40、60、80、100 s時(shí)對(duì)無(wú)花果總黃酮提取量的影響,確定適宜的提取時(shí)間。

1.2.2.4 液料比對(duì)無(wú)花果總黃酮提取的影響 固定提取電壓為150 V,固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%,提取時(shí)間為60 s,考察液料比分別為30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1 mL/g時(shí)對(duì)無(wú)花果總黃酮提取量的影響,從而確定適宜的液料比。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,按照Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,采用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)以無(wú)花果總黃酮提取量為響應(yīng)值,選取提取電壓、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間以及液料比四個(gè)因素三水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探究,因素水平見表1。

表1 因素水平編碼Table 1 Coded of factors and levels

1.2.4 黃酮提取量的計(jì)算

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品25 mg置于50 mL容量瓶中,加入無(wú)水乙醇溶解并且將其定容至刻度線,搖勻即得蘆丁對(duì)照品溶液。精確吸取蘆丁對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL,分別置于10 mL的容量瓶中,各加入5 mL蒸餾水,加入5% NaNO20.6 mL,搖勻后靜置6 min,加入10% AgNO30.6 mL,搖勻后靜置6 min,加入5% NaOH 3 mL,加水至刻度,搖勻后放置20 min。于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度A,以吸光度為橫坐標(biāo),蘆丁濃度(mg/mL)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=1.0472x+0.0116,R2=0.9996

1.2.4.2 無(wú)花果黃酮含量的測(cè)定及提取量計(jì)算 準(zhǔn)確量取0.7 mL的樣液于10 mL的比色皿中,在紫外可見分光光度計(jì)中測(cè)得樣液的吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算黃酮濃度,按照公式(1)即可計(jì)算出無(wú)花果黃酮提取量。

式(1)

式中:W為無(wú)花果總黃酮提取量(mg/g),c為總黃酮濃度(mg/mL),D為提取溶液體積(mL),m為無(wú)花果粉的質(zhì)量(g)。

1.2.5 無(wú)花果總黃酮體外抗氧化試驗(yàn)

1.2.5.1 無(wú)花果總黃酮對(duì)DPPH自由基清除活性測(cè)定 方法參照文獻(xiàn)[20-22]并做適當(dāng)修改,取最佳提取工藝條件下的無(wú)花果總黃酮提取物,加無(wú)水乙醇配制成含總黃酮濃度為0.03、0.06、0.08、0.10、0.14、0.20、0.26、0.30 mg/mL的樣品溶液。抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品為陽(yáng)性對(duì)照,加無(wú)水乙醇配制成與總黃酮濃度相同的8種不同濃度。于試管中加入3 mL 2×10-4mol/L的DPPH溶液,再分別加入1 mL配制好的無(wú)花果溶液或抗壞血酸溶液(0.03～0.3 mg/mL),充分混勻,并在室溫避光放置30 min后在517 nm處測(cè)定各組吸光度A1,以無(wú)水乙醇為空白對(duì)照組在517 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)2,對(duì)照組用無(wú)水乙醇代替樣品測(cè)定吸光度A0,按公式(2)計(jì)算清除率以及IC50。

DPPH自由基清除率(%)=[(A0-A1+A2)/A0]×100

式(2)

1.2.5.2 無(wú)花果總黃酮對(duì)OH自由基清除能力的測(cè)定 方法參照文獻(xiàn)[23]并做適當(dāng)修改,雙氧水與二價(jià)鐵離子反應(yīng)生成OH,加入水楊酸與OH生成有色物質(zhì),在517 nm處有最大吸收峰。取1 mL配制好的樣品溶液或抗壞血酸溶液(0.03～0.3 mg/mL)分別加入1 mL濃度為9 mmol/L的水楊酸,然后加入1 mL濃度為9 mmol/L的硫酸亞鐵,最后加入1 mL濃度為9 mmol/L雙氧水,反應(yīng)30 min,在517 nm處測(cè)定吸光度A1?？瞻讓?duì)照組用1 mL水代替雙氧水,其余步驟同上,測(cè)定吸光度A0。最后用水代替黃酮提取液,測(cè)定吸光度A2。按公式(3)計(jì)算清除率以及IC50。

OH自由基清除率(%)=[1-(A1-A0)/A2]×100

式(3)

1.2.5.3 無(wú)花果總黃酮對(duì)ABTS+自由基清除能力的測(cè)定 方法參考王晶晶[24]以及Re等[25]的測(cè)定方法并作適當(dāng)調(diào)整,測(cè)定無(wú)花果總黃酮對(duì)于ABTS自由基的清除能力。配制磷酸緩沖鹽(PBS),用PBS作為溶劑配制出濃度為7 mmol/L的ABTS溶液并置于0～4 ℃保存。用PBS作為溶劑配制濃度為2.5 mmol/L的K2S2O8溶液。取50 mL ABTS溶液與50 mL K2S2O8溶液等體積混合,25 ℃避光反應(yīng)12～16 h,使用前用無(wú)水乙醇將其稀釋,使其在25 ℃,734 nm波長(zhǎng)下吸光度為0.7±0.02。分別取1 mL配制好的樣品溶液或抗壞血酸溶液(0.03～0.3 mg/mL)和3 mL ABTS工作液充分混勻,在室溫下反應(yīng)30 min后,于734 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值為A1。取1 mL PBS溶液加3 mL ABTS自由基稀釋液并測(cè)定吸光值為A0,取1 mL無(wú)花果總黃酮稀釋液加3 mL PBS溶液測(cè)定其吸光度值為A2按(4)即可計(jì)算出清除率以及IC50值。

ABTS+自由基清除率(%)=[(A0-A1+A2)/A0]×100

式(4)

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)無(wú)花果總黃酮提取量的影響 由圖1可見,乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)無(wú)花果總黃酮的提取有較大影響。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%～50%時(shí)總黃酮提取量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增大,進(jìn)一步提高乙醇體積分?jǐn)?shù)后總黃酮提取量呈下降趨勢(shì),這與蘇適等[26]、黃丹丹[27]的無(wú)花果黃酮提取研究結(jié)果一致。這是由于在乙醇體積分?jǐn)?shù)大于50%時(shí),無(wú)花果中的色素,脂溶物質(zhì)和糖類等雜質(zhì)大量溶出從而降低了總黃酮物質(zhì)的溶解[28]。在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí),溶劑與無(wú)花果黃酮類物質(zhì)極性最接近因而總黃酮提取量達(dá)到最大,為28.53 mg/g。

圖1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)無(wú)花果總黃酮提取量的影響Fig.1 Effect of different ethanol concentrationson the yield of total flavonoids in figs

2.1.2 提取電壓對(duì)無(wú)花果總黃酮提取量的影響 從圖2可見,提取電壓對(duì)無(wú)花果總黃酮的提取有較大影響。當(dāng)提取電壓為75～150 V時(shí),總黃酮提取量隨著電壓的增大而增大,進(jìn)一步提高提取電壓后無(wú)花果總黃酮提取量呈下降趨勢(shì)。這是由于當(dāng)提取電壓大于150 V,閃式提取器的刀頭轉(zhuǎn)速也增大,無(wú)花果粒徑變小從而引起表面能增大,使其被吸附在固體表面或細(xì)微粒間相互粘聯(lián),不易溶解,因而總黃酮提取量降低[29]。當(dāng)提取電壓為150 V時(shí),總黃酮提取量達(dá)到最大,為19.16 mg/g。

圖2 不同提取電壓對(duì)無(wú)花果總黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of different extraction voltageson yield of total flavonoids in figs

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)無(wú)花果總黃酮提取量的影響 從圖3可見,提取時(shí)間對(duì)無(wú)花果總黃酮的提取有較大影響。當(dāng)提取時(shí)間為20～80 s時(shí),無(wú)花果總黃酮提取量隨著溫度的升高而增大,進(jìn)一步延長(zhǎng)提取時(shí)間后無(wú)花果總黃酮提取量呈下降趨勢(shì)。當(dāng)提取時(shí)間大于80 s時(shí),黃酮提取量下降可能是由于隨著提取時(shí)間延長(zhǎng),閃式提取器頭部產(chǎn)生大量的熱量,提取溶劑溫度升高,使黃酮類物質(zhì)發(fā)生如氧化或分解等副反應(yīng),從而導(dǎo)致黃酮類化合物含量下降[30]。在提取時(shí)間為80 s時(shí),總黃酮提取量達(dá)到最大,為20.48 mg/g。

圖3 不同提取時(shí)間對(duì)無(wú)花果總黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of different extraction timeson the yield of total flavonoids in figs

2.1.4 液料比對(duì)無(wú)花果總黃酮提取量的影響 從圖4可見,液料比對(duì)無(wú)花果總黃酮的提取有影響。當(dāng)液料比為30～50 mL/g時(shí),無(wú)花果總黃酮提取量隨著液料比增大而增大,進(jìn)一步加大液料比后,無(wú)花果總黃酮提取量呈下降趨勢(shì),這與彭珊珊等[31]的無(wú)花果黃酮研究結(jié)果一致。這是由于當(dāng)液料比過(guò)小時(shí)溶劑未能與樣品充分接觸,細(xì)胞內(nèi)外的濃度差較低影響了總黃酮的傳質(zhì)效率所以其提取量較低,隨著液料比的增大,無(wú)花果總黃酮提取量隨之增大,當(dāng)液料比大于50 mL/g時(shí)單位體積溶劑內(nèi)總黃酮含量降低,被溶解的黃酮容易發(fā)生變性分解,因而總黃酮提取量降低[32]。液料比為50 mL/g時(shí),總黃酮提取量達(dá)到最大,為19.16 mg/g。

圖4 不同液料比對(duì)無(wú)花果總黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of different liquid materialson the yield of total flavonoids in figs

2.2 Box-Behnken響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面回歸模型建立與分析 采用Box-Behnken的中心組合的原理為依據(jù),以乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、提取電壓(B)、液料比(C)、提取時(shí)間(D)為自變量,無(wú)花果總黃酮提取量為因變量,采用四水平三因素響應(yīng)面優(yōu)化無(wú)花果總黃酮提取工藝條件,結(jié)果見下表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface experiment results and analysis

利用軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸模型擬合獲得如下的回歸模型Y=36.94-0.94A-0.82B-1.29C+0.049D-1.36AB-4.47BC-1.06BD+1.3CD-7.88A2-7.98B2-8.17C2-8.62D2

式中:Y為無(wú)花果總黃酮提取量。

表3 回歸模型分析Table 3 Regression model analysis

由四個(gè)自變量的F值可以得出各因素對(duì)無(wú)花果總黃酮提取量的影響順序?yàn)樘崛‰妷?液料比>乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取時(shí)間,提取時(shí)間對(duì)無(wú)花果總黃酮提取量有較大的影響,模型一次項(xiàng)B、C,二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2以及交互項(xiàng)AB、BC對(duì)指標(biāo)影響極顯著(P<0.01),一次項(xiàng)A對(duì)指標(biāo)影響顯著(P<0.05),而一次項(xiàng)D,交互項(xiàng)BD、CD對(duì)指標(biāo)影響不顯著(P>0.05)。

2.2.2 響應(yīng)曲面分析 通過(guò)多元回歸模型,進(jìn)行兩因素交互分析,可以得到兩因素對(duì)類黃酮提取量的影響的響應(yīng)面及等高線圖,如圖5。

圖5 提取參數(shù)顯著性交互作用對(duì)無(wú)花果總黃酮提取量的響應(yīng)面曲面圖Fig.5 Response surface plots of the significant interactionson the yields of fig total flavonoids

對(duì)于響應(yīng)面來(lái)說(shuō),三維圖曲面越陡峭說(shuō)明這兩個(gè)因素對(duì)于因變量影響就越大,而曲面越平緩,說(shuō)明這兩種因素對(duì)于因變量的影響就越小。如圖5所示,在有交互作用的影響下,乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取電壓、液料比和提取電壓的曲面比較陡峭,說(shuō)明這些因素對(duì)于無(wú)花果黃酮提取量影響較大。

2.3 最佳提取條件的確定及驗(yàn)證

軟件分析結(jié)果顯示,無(wú)花果總黃酮的最佳提取工藝條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)49.44%,提取電壓149.29 V,液料比49.83∶1 mL/g,提取時(shí)間81.04 s?？紤]實(shí)際實(shí)驗(yàn)操作因素,可將實(shí)驗(yàn)條件調(diào)整為:乙醇體積分?jǐn)?shù)50%,提取電壓150 V,液料比50∶1 mL/g,提取時(shí)間80 s。無(wú)花果總黃酮提取量的實(shí)際實(shí)驗(yàn)值為(36.94±0.02) mg/g,而預(yù)測(cè)值為36.98 mg/g,預(yù)測(cè)誤差僅為0.103%,小于3%,因此證實(shí)了預(yù)測(cè)值的準(zhǔn)確性。

2.4 無(wú)花果總黃酮體外抗氧化活性研究

2.4.1 無(wú)花果總黃酮對(duì)DPPH自由基清除作用 在無(wú)花果總黃酮提取液濃度為(0.03～0.08 mg/mL)范圍內(nèi),隨著濃度的增加,黃酮對(duì)DPPH自由基的清除能力呈上升趨勢(shì)。在濃度為(0.08～0.14 mg/mL)時(shí)其清除能力隨著濃度的增加而緩慢增加,當(dāng)濃度到達(dá)0.14 mg/mL時(shí),無(wú)花果總黃酮對(duì)于DPPH溶液的清除率高達(dá)98.79%,此后清除率基本不變。由此可知無(wú)花果總黃酮對(duì)DPPH自由基具有很好的清除能力且具優(yōu)于相同濃度的對(duì)照(抗壞血酸)(圖6)。

圖6 無(wú)花果總黃酮對(duì)DPPH自由基清除作用Fig.6 Determination of DPPH free radicalscavenging rate of figs total flavones

2.4.2 無(wú)花果總黃酮對(duì)OH自由基清除作用 隨著無(wú)花果總黃酮的濃度從0.03 mg/mL提升到0.10 mg/mL時(shí),對(duì)OH自由基的清除能力呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。當(dāng)總黃酮濃度達(dá)到0.10 mg/mL后,進(jìn)一步增大總黃酮濃度,清除率繼續(xù)提高但趨勢(shì)變緩,當(dāng)濃度達(dá)到0.30 mg/mL時(shí),對(duì)OH自由基的清除率高達(dá)95.2%,表明無(wú)花果總黃酮具有較好的清除OH自由基的能力,且均高于相同濃度的對(duì)照(抗壞血酸)(圖7)。并計(jì)算得到無(wú)花果總黃酮IC50=0.098 mg/mL,抗壞血酸的IC50=0.159 mg/mL,說(shuō)明在同等濃度下無(wú)花果總黃酮對(duì)于OH自由基的清除效果較好。這是由于無(wú)花果總黃酮中某些成分與OH自由基進(jìn)行結(jié)合,同時(shí)還阻止了Fenton反應(yīng)的發(fā)生[2]。

圖7 無(wú)花果總黃酮對(duì)OH自由基清除作用Fig.7 Determination of OH free radicalscavenging rate of figs total flavones

2.4.3 無(wú)花果總黃酮對(duì)ABTS+自由基清除作用 在(0.03～0.14 mg/mL)濃度范圍內(nèi),隨著無(wú)花果總黃酮濃度的提升,ABTS+自由基的清除率在不斷提高,當(dāng)總黃酮濃度達(dá)到0.14 mg/mL時(shí),進(jìn)一步增大總黃酮濃度,清除率繼續(xù)提高但趨勢(shì)變緩。當(dāng)濃度為0.30 mg/mL時(shí),ABTS+·清除率達(dá)到79.8%,表明無(wú)花果總黃酮有較好的清除ABTS+自由基的能力,但低于相同濃度的抗壞血酸對(duì)照(ABTS+自由基清除率為93%)(圖8),說(shuō)明在相同濃度條件下抗壞血酸對(duì)于ABTS自由基的清除效果較好。

圖8 無(wú)花果總黃酮對(duì)ABTS+自由基清除作用Fig.8 Determination of ABTS+ free radicalscavenging rate of figs total flavones

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過(guò)響應(yīng)面建立了無(wú)花果提取工藝的二次項(xiàng)回歸方程,該模型顯著性良好,所得的方程擬合度高。最終確定的最佳提取方案條件為:提取電壓150 V,提取時(shí)間80 s,液料比50∶1 mL/g,乙醇體積分?jǐn)?shù)50%,并且最終提取量高達(dá)(36.94±0.02) mg/g。無(wú)花果總黃酮的提取量比文獻(xiàn)[8]和[9]分別提高了76.84%、47.53%?？赡苁翘崛》椒ú煌?閃式提取法更有利于黃酮的充分溶解;也可能與產(chǎn)地有較大的關(guān)系,具體新疆無(wú)花果與別的地區(qū)所產(chǎn)無(wú)花果的總黃酮提取量和抗氧化性能有何差異,還待進(jìn)一步研究。

抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示無(wú)花果總黃酮具有較好的抗氧化活性,與對(duì)照抗壞血酸相比,其對(duì)DPPH自由基和OH自由基清除效果更好,而對(duì)于ABTS+自由基的清除效果弱于抗壞血酸。人體內(nèi)過(guò)量的自由基會(huì)導(dǎo)致炎癥、腫瘤等健康問(wèn)題[33],相關(guān)結(jié)果表明無(wú)花果總黃酮具有應(yīng)用在抗氧化功能性食品、藥品上的潛能。