李偉民,張瑩麗,劉可玉,鄭麗娟,魏泉增

(1.許昌學(xué)院食品與生物工程學(xué)院,河南省食品安全生物標(biāo)識快檢技術(shù)重點實驗室,河南許昌 461000;2.鄢陵縣市場監(jiān)督管理局,河南鄢陵 461200)

紫花苜蓿在我國各地均有種植[1]。苜蓿鮮草中蛋白含量達(dá)5.9%[2],苜蓿干草中蛋白質(zhì)含量能夠達(dá)到22%以上,含有的氨基酸種類多樣[3]。但大多數(shù)直接提取的苜蓿葉蛋白很難被直接利用,且具有很強的抗原性,表現(xiàn)為較低的消化率和生物效價[4],故苜蓿蛋白產(chǎn)業(yè)的發(fā)展受到一定的阻礙。

苜蓿蛋白經(jīng)過酶法水解后制備的多肽對人體具有重要作用,多肽是涉及人體內(nèi)多種細(xì)胞功能的重要物質(zhì),具有預(yù)防心腦血管疾病、促進(jìn)造血功能、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌與神經(jīng)系統(tǒng)[5]等方面疾病。多肽類藥物在這些疾病的治療上具有顯著效果[6]。多肽不僅可以提高物質(zhì)的利用價值,還可賦予物質(zhì)一定的生物學(xué)活性,尤其是在增強抑菌性[7]、免疫性[8]和抗氧化性[9]等方面。

近年來,多肽的制備多選用綠豆[10]、葵花籽[11]、海參[12]、魚籽[13]等原料,而這些原材料通常價格昂貴或不易獲取。而本實驗采用苜蓿為原材料,苜蓿易獲得,經(jīng)濟(jì)價值低,種質(zhì)資源豐富。對苜蓿多肽的制備方法的研究較少。本研究利用堿性蛋白酶對苜蓿進(jìn)行酶解制備多肽,可充分利用苜蓿的蛋白資源,開發(fā)苜蓿的潛在價值,提高苜蓿的綜合利用價值。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

紫花苜蓿、堿性蛋白酶(20萬U/g) 食品級,南寧龐博生物工程有限公司;酪蛋白、氫氧化鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、鹽酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硫酸亞鐵、過氧化氫、三氯乙酸、水楊酸、三羥甲基氨基甲烷 天津市科密歐化工有限公司;無水乙醇、抗壞血酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 天津醫(yī)藥化學(xué)有限公司;上述試劑 均為分析純。

FA2014B分析天平、PHS-3C型pH計 上海佑科儀器儀表有限公司;TG16-WS離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;T6可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;Dk-8D水浴鍋 常州普天儀器制造有限公司;DL-1型電爐 中興偉業(yè)儀器有限公司;750t型粉碎機(jī) 鶴壁市天冠儀器儀表有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 多肽溶液制備 準(zhǔn)確稱取一定量的苜蓿粉于反應(yīng)容器中,依照蛋白酶添加量加入一定量的堿性蛋白酶溶液,調(diào)整到預(yù)設(shè)pH,緩慢攪拌,在一定溫度下酶解一定的時間,酶解過程中注意維持酶解系統(tǒng)pH恒定。酶解結(jié)束后將酶液迅速置于沸水中滅酶10 min。冷卻至室溫后4000 r/min離心10 min,收集上清液。

1.2.2 單因素實驗 在蛋白酶添加量3000 U/g、酶解溫度50 ℃、酶解時間4 h、酶解pH9.0的條件下,分別研究堿性蛋白酶添加量(1000、2000、3000、4000、5000 U/g),酶解溫度(40、45、50、55、60 ℃),酶解時間(2、3、4、5、6 h),酶解pH(7.0、8.0、9.0、10.0、11.0)四個因素對溶液中多肽含量的影響。

1.2.3 響應(yīng)面實驗 在單因素實驗結(jié)果探索最適酶解時間、最適酶解pH、最適酶解溫度、最適堿性蛋白添加量的基礎(chǔ)上,選取其中的酶解時間、酶解pH、酶解溫度作響應(yīng)面綜合分析。采用Design-expert 8.0.6軟件中心組合實驗進(jìn)行多肽含量提取最佳工藝。實驗方案見表2。

表2 實驗因素和水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken test

1.2.4 多肽含量的測定

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 溶液中多肽含量測定方法采用雙縮脲法[14]。標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方式見表1。在試管中加入一定量的10 mg·mL-1酪蛋白溶液,其中不足1 mL的用蒸餾水補至1 mL,以1.0 mL的蒸餾水為空白,最后向各試管中加入的雙縮脲試劑4 mL,充分混勻,室溫下反應(yīng)30 min,然后用721分光光度計在540 nm處測其吸光值,作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程:y=0.0435x+0.0009,相關(guān)系數(shù)R2=0.9999。

表1 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制Table 1 Preparation of protein standard curve

1.2.4.2 多肽濃度測定 將收集到的上清液定容至100 mL,搖勻移取溶液5 mL,加入10%的三氯乙酸溶液5 mL,混勻后放置10 min,4000 r·min-1離心5 min,靜置30 min后,取上清液1 mL,并和4 mL雙縮脲試劑混合,室溫下靜置30 min,以蒸餾水為空白,測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線關(guān)系式,計算多肽濃度。

1.2.5 抗氧化性測定

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力的測定 DPPH自由基清除能力的測定參考王惠敏等[15]方法。向2 mL的酶解液中加入0.04 mg/mL的DPPH無水乙醇溶液2 mL,混合均勻,在黑暗環(huán)境中反應(yīng)30 min,用無水乙醇作空白對照,在517 nm下測定其吸光值,VC做標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑(A0)。

式(1)

式中:A0為空白組(DPPH自由基+蒸餾水)吸光度;A1為樣品組(2 mL樣品溶液+2 mL DPPH溶液)吸光度;A2為空白組(2 mL 95%乙醇溶液+2 mL DPPH溶液)吸光度。

1.2.5.2 羥自由基清除能力的測定 羥自由基清除能力的測定采用Fenton體系,參考龍曉珊等[16]方法。

1.2.5.3 超氧陰離子自由基清除能力的測定 超氧陰離子自由基清除能力的測定參考王俏等[17]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

響應(yīng)面實驗結(jié)果利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行分析,建立回歸方程并作等高線和三維曲面圖,對任意兩種因素的交互效應(yīng)進(jìn)行分析和評價,得到最優(yōu)工藝組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 蛋白酶添加量對酶解效果的影響 蛋白酶添加量對酶解效果的影響如圖1所示。苜蓿在堿性蛋白酶添加量1000 U/g的條件下多肽含量最低,隨著蛋白酶添加量增加,水解度不斷增大,當(dāng)堿性蛋白酶添加量達(dá)到3000 U/g時,多肽含量最高,隨著蛋白酶量繼續(xù)增加,多肽含量下降。當(dāng)酶濃度過高時,酶分子間可能相互水解,導(dǎo)致酶解效果下降[18]。

圖1 蛋白酶添加量對苜蓿多肽含量的影響Fig.1 Effect of protease dosage on peptide yield of alfalfa

2.1.2 酶解pH對酶解效果的影響 酶解pH對酶解效果的影響如圖2所示。在pH為7的條件下所得的多肽含量最小,在pH7.0～9.0范圍內(nèi),隨著pH的增加,酶解液中多肽含量逐步增加,在酶解pH為9.0時多肽含量最大,pH在9.0到11.0的范圍內(nèi),隨著pH的增加,多肽含量逐漸下降。酶解最適pH為9.0。

圖2 酶解pH對苜蓿多肽含量的影響Fig.2 Effect of pH on peptide yield of alfalfa

2.1.3 酶解溫度對酶解效果的影響 酶解溫度對酶解效果的影響如圖3所示,溶液中多肽含量呈現(xiàn)先緩慢上升后逐漸下降趨勢。在40～50 ℃范圍內(nèi),溶液中多肽含量隨酶解溫度的升高逐漸增多。當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時,苜蓿多肽含量最高,隨后繼續(xù)增大溫度,多肽含量開始下降,當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃時,苜蓿多肽含量最低,溫度偏高或偏低會抑制堿性蛋白酶的活性,溫度過高會導(dǎo)致堿性蛋白酶逐漸失活,影響酶解效果,酶解溫度應(yīng)為50 ℃。

圖3 酶解溫度對苜蓿多肽含量的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperatureon peptide yield of alfalfa

2.1.4 酶解時間對酶解效果的影響 酶解時間對酶解效果的影響如圖4所示。在酶解2 h的條件下多肽含量最低,隨著酶解時間的增加,多肽含量隨之增加,在酶解時間為5 h時多肽含量最大,隨著酶解時間繼續(xù)增加,苜蓿多肽含量下降。這可能是由于隨著酶解時間的延長,短鏈的多肽片段被繼續(xù)水解為氨基酸[15]。酶解最適時間為5 h。

圖4 酶解時間對苜蓿多肽含量的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on peptide yield of alfalfa

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面法實驗分析及結(jié)果 由四個單因素結(jié)果選取其中的酶解時間(A)、酶解pH(B)、酶解溫度(C)這三個因素作為參考依據(jù),以多肽含量為指標(biāo)。進(jìn)行響應(yīng)面實驗,確定堿性蛋白酶水解制備苜蓿多肽的最佳工藝條件。響應(yīng)面實驗方案及結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results ofrespond surface experimental test

表4 回歸分析結(jié)果Table 4 Analysis results of regression and variance

圖5直觀反映了不同兩因素之間的交互作用對多肽含量的影響,曲面越彎曲,兩因素交互作用對多肽含量的影響越顯著[19]。酶解pH、酶解時間的圖形曲線走勢較陡,說明其影響最為顯著。兩兩因子交互作用是否顯著也與等高線圖形相關(guān),等高線圖形呈橢圓形,表明各因子的交互作用顯著。由等高線疏密和性狀可知,酶解時間和酶解pH、酶解pH和酶解溫度的交互作用對酶解液中多肽含量的影響具有顯著性,酶解時間和酶解溫度對酶解液中多肽含量的影響不顯著。

圖5 不同兩因素之間交互作用對酶解液中多肽含量的影響Fig.5 Effects of the interactions between different two factors on polypeptide content in the enzymatic hydrolysates

2.3 苜蓿蛋白酶解工藝的確定及優(yōu)化工藝條件驗證

經(jīng)Box-Behnken實驗設(shè)計,Design-export 8.0.6軟件分析得出最優(yōu)條件為:酶解pH為8.79,時間4.9 h,溫度49.95 ℃。此條件下酶解液中多肽含量為4.95 mg·mL-1。將工藝參數(shù)酶解時間調(diào)整為4.9 h,溫度為49.9 ℃,pH為8.79,在此工藝測定的多肽含量為4.94 mg·mL-1。與理論條件下的多肽含量較為接近?？梢宰C明模型可靠,方程能夠比較真實的反映各因素對多肽含量影響的實際情況。通過軟件建造的模型也能真實直觀的反映情況,模型與實際情況貼近吻合,此響應(yīng)面的數(shù)據(jù)處理真實有效。

2.4 最優(yōu)工藝條件下制備的苜蓿多肽抗氧化測試

對最優(yōu)工藝下制備的苜蓿多肽含量進(jìn)行測定,結(jié)果為4.94 mg·mL-1,稀釋后,測定其抗氧化活性,結(jié)果如圖6所示。1 mg·mL-1濃度下陽性對照VC對DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基的清除率分別為95.69%、91.14%和93.12%。1 mg·mL-1樣品對DPPH自由基清除率為61.53%,對羥自由基的清除率可達(dá)74.61%,對超氧陰離子自由基的清除能力為72.14%,苜蓿多肽清除自由基的能力低于VC,但苜蓿多肽對三種自由基的清除率均較高,表現(xiàn)出較好的抗氧化能力。

圖6 苜蓿多肽清除自由基清除能力Fig.6 Free radicals scavenging activity of alfalfa peptides

3 結(jié)論

本實驗為利用我國苜蓿蛋白資源,提高苜蓿的附加值,探討了在單因素基礎(chǔ)上,進(jìn)行響應(yīng)面實驗對苜蓿蛋白酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化,苜蓿多肽制備的最優(yōu)條件為加酶量3000 U/g,酶解pH8.79,酶解溫度49.9 ℃,酶解時間4.9 h。在此條件下,測得溶液中多肽的含量最高,為4.94 mg·mL-1,與預(yù)測值兩者之間的相對誤差為0.2%。在該條件下,1 mg·mL-1樣品對羥自由基和超氧陰離子自由基的清除能力較強,分別為74.61%和72.14%,對DPPH自由基清除能力較弱,為61.53%,苜蓿多肽抗氧化能力低于相同濃度下的VC,但苜蓿多肽對三種自由基均表現(xiàn)出較好的抗氧化能力,說明苜蓿多肽具有良好的抗氧化活性。