吳明澤,王 壘,王 笑,李 婷,胡祥昊,董丹華,李亞男,馬青琳,代 龍,高 鵬,*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,山東濟(jì)南 250355;2.凱萊英生命科學(xué)技術(shù)(天津)有限公司,天津 300457;3.山東省文登整骨醫(yī)院藥學(xué)部,山東威海 264400;4.濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,山東煙臺(tái) 264003)

雞胚蛋又稱“活珠子”,是南京著名的特產(chǎn),屬金陵小吃。李時(shí)珍《本草綱目》中有記載:“雞胚蛋,性溫?zé)o毒,主添精,助氣益血,扶虛,治男女虛勞,矢志恍惚?！笨梢?jiàn)雞胚可能具有一定的增強(qiáng)免疫的功能。研究表明,雞胚經(jīng)過(guò)酶解可降低蛋白的過(guò)敏原性,獲取一些具有重要生物活性的小肽[1]。鋅對(duì)增強(qiáng)人體內(nèi)的體液及細(xì)胞的免疫功能意義重大,能夠增強(qiáng)吞噬細(xì)胞吞噬病原體的功能,調(diào)整病變組織周?chē)难髁考拔镔|(zhì)代謝,從而達(dá)到增強(qiáng)局部和整體機(jī)能狀態(tài)的目的[2]。而傳統(tǒng)的補(bǔ)鋅劑如硫酸鋅等,存在吸收率差、副作用大、易刺激腸胃、在體內(nèi)蓄積中毒等[3]問(wèn)題,肽與微量元素的螯合產(chǎn)物可以避免這些問(wèn)題,它不僅能促進(jìn)肽的吸收,同時(shí)也能補(bǔ)充人體所需要的微量元素。

近年來(lái),對(duì)于肽螯合微量元素免疫活性的研究逐漸增加。左愛(ài)玲[4]發(fā)現(xiàn)鈣螯合膠原肽能夠在防治骨質(zhì)疏松的同時(shí),增強(qiáng)正常大鼠的免疫力。張智等[5]發(fā)現(xiàn)玉米肽鋅螯合物能夠能提高非特異性免疫、細(xì)胞免疫、體液免疫功能。梁營(yíng)芳等[6]發(fā)現(xiàn)適量的帶魚(yú)酶解蛋白亞鐵螯合肽可以提高對(duì)蝦的免疫相關(guān)指標(biāo)。針對(duì)雞胚肽的活性研究相對(duì)較少,Xue等[7]對(duì)雞胚抗氧化活性肽進(jìn)行了分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定,而螯合微量元素的雞胚肽活性研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

因此,本實(shí)驗(yàn)以雞胚蛋為原材料,通過(guò)分步酶解法制備雞胚肽,將雞胚肽與鋅元素螯合,以螯合率為指標(biāo)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)考察,響應(yīng)面法優(yōu)化螯合工藝,篩選出最佳螯合工藝,結(jié)合免疫調(diào)節(jié)藥效學(xué)研究驗(yàn)證其藥效。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)可探索雞胚肽鋅螯合物的免疫活性研究,為以后雞胚肽在功能性食品及保健食品等開(kāi)發(fā)提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞胚蛋浙江省 南京六合丹田農(nóng)場(chǎng);昆明種封閉群無(wú)菌型小白鼠(體重20±2 g),健康狀況良好,共60只,雌雄各半,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(魯)2017-0011 濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司;胰蛋白酶(100000 U/g)、堿性蛋白酶(100000 U/g) 上海源葉生物科技有限公司;茚三酮、鉻黑T(均為分析純) 濟(jì)南躍陽(yáng)化工有限公司;鋅單元素 中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院;3,3′-二氨基聯(lián)苯胺、乙二胺四乙酸二鈉鹽、乙二胺四乙酸(均為分析純) 天津金匯太亞化學(xué)試劑有限公司;注射用環(huán)磷酰胺 江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。

R-301型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申順生物科技有限公司;GZX-9030MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱 吳江宏昌有限公司;DS-1型高速組織搗碎機(jī) 無(wú)錫沃信儀器有限公司;JM-L50型膠體磨 上海諾尼輕工機(jī)械有限公司;PK-S24型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;SW-CJ-2FD型磁力攪拌器 上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司;JM-L50型冷凍干燥機(jī) 上海諾尼輕工機(jī)械有限公司;FE-20型pH計(jì) 梅特勒儀器有限公司;UV1100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司;AB135-S型十萬(wàn)分之一天平、AL-204型萬(wàn)分之一天平 上海精科實(shí)業(yè)有限公司;JB-500型精密扭力天平 上海維菱科學(xué)儀器有限公司;DT5-2型離心機(jī) 北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司;iCE 3300 AAS型原子吸收光譜儀 賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;TANK PRO型微波消解儀 上海新儀微波化學(xué)科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雞胚肽凍干粉的制備 將雞胚蛋洗凈,去殼,用組織搗碎機(jī)高速搗碎,加入8倍量去離子水,膠體磨對(duì)其進(jìn)行勻漿處理,煮沸20 min,進(jìn)行高溫殺菌,待溫度降至55 ℃,調(diào)節(jié)pH至8.0,加入3%的堿性蛋白酶,酶解3 h;待降溫至37 ℃,加入2%的胰蛋白酶,繼續(xù)酶解2 h;煮沸,高溫殺酶15 min,迅速冷卻至室溫,放置冰箱低溫(4 ℃左右)冷藏過(guò)夜,離心(4500 r/min)10 min,取上清液,濃縮,-24 ℃預(yù)冷凍5 h(或-80 ℃預(yù)冷凍1 h),冷凍干燥24 h(-45 ℃,23 Pa),得雞胚肽凍干粉。

1.2.2 雞胚肽螯合鋅元素的工藝 取雞胚肽凍干粉,加適量的水溶解,在一定的螯合pH條件下,按照需要的比例加入一定的鋅溶液混合均勻,在一定溫度下螯合一定時(shí)間,用95%乙醇醇沉,將醇沉液置于低溫高速離心機(jī)中在4500 r/min條件下離心20 min,取沉淀物,將沉淀物加入95%乙醇進(jìn)行二次洗滌后,離心,將制得的雞胚肽鋅螯合物,置于-24 ℃下預(yù)冷凍5 h(或-80 ℃下預(yù)冷凍1 h),放置于凍干機(jī)中凍干24 h(-45 ℃,23 Pa),粉碎,即得雞胚肽鋅螯合物凍干粉。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 以螯合率及螯合物得率為考察指標(biāo),進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)[8],分別考察螯合pH(A)、螯合溫度(B)、雞胚肽與鋅濃度比(C)、螯合時(shí)間(D)對(duì)雞胚肽鋅螯合反應(yīng)的影響,每個(gè)因素5個(gè)水平。在螯合溫度70 ℃、雞胚肽與鋅濃度比為2.0∶1、螯合時(shí)間2.0 h條件下考察螯合pH的影響,水平設(shè)置為6、7、8、9、10;在螯合pH為8、雞胚與鋅濃度比為2.0∶1、螯合時(shí)間為2.0 h條件下考察螯合溫度的影響,水平設(shè)置為50、60、70、80、90 ℃;在螯合pH8、螯合溫度70 ℃、螯合時(shí)間2.0 h條件下考察雞胚肽與鋅濃度比的影響,水平設(shè)置為1.0∶1、1.5∶1、2.0∶1、2.5∶1、3.0∶1;在螯合pH為8、螯合溫度70 ℃、雞胚肽與鋅濃度比為2.0∶1條件下考察螯合時(shí)間的影響,水平設(shè)置為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[9],以螯合率為指標(biāo),選取螯合pH(A)、螯合溫度(B)、雞胚肽與鋅濃度比(C)以及螯合時(shí)間(D)四個(gè)因素為自變量,采用軟件Design-Expert V8.0.6.1設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn),因素與水平設(shè)計(jì)如表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface test

1.2.5 螯合率、螯合物得率的測(cè)定 螯合率的測(cè)定首先根據(jù)GB 5009.14-2017《食品中鋅的測(cè)定》的測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定雞胚肽鋅螯合物中鋅的質(zhì)量。其中原子吸收光譜儀設(shè)定參數(shù)為:測(cè)定波長(zhǎng)為213.9 nm,通帶0.2 nm,燈電流為75%,燃?xì)饬髁繛?.2 L/min,燃燒器高度為7.0 mm,計(jì)算螯合率和螯合物得率。

式(1)

式中:M0:反應(yīng)體系鋅的總質(zhì)量,mg;M1:雞胚肽中鋅的質(zhì)量,mg;M2:雞胚肽鋅螯合物中鋅的總質(zhì)量,mg。

式(2)

式中:W0:反應(yīng)物的總重量,mg;W1:反應(yīng)生成的螯合物重量,mg。

1.2.6 雞胚肽鋅螯合物的免疫調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn) 免疫調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)采用免疫器官-胸腺和脾臟質(zhì)量指數(shù)法[10]測(cè)定。將小鼠隨機(jī)分為5組,每個(gè)劑量組12只,共60只。小鼠適應(yīng)性培養(yǎng)5 d,飼養(yǎng)環(huán)境為屏障環(huán)境,環(huán)境溫度為22～26 ℃、相對(duì)濕度為50%～70%,飼養(yǎng)室提供12/12 h的晝夜交替時(shí)間,非工作時(shí)間使用動(dòng)物照度[11]。小鼠正常飲食采水,每天灌胃1次,灌胃劑量1 mL/100 g,共灌胃30 d[12]。正常對(duì)照組、模型組生理鹽水給藥;實(shí)驗(yàn)組:富鋅雞胚肽低、中、高劑量組給藥濃度分別為5、10、20 mg/mL。在灌胃的最后4 d開(kāi)始在模型組和實(shí)驗(yàn)組腹腔注射0.25 mL的環(huán)磷酰胺注射液,注射時(shí)間為灌胃后4 h,注射藥物期間小鼠飲食采水量相對(duì)減少,活動(dòng)和精神狀態(tài)減弱[13],體重增加值、飼料效率等指標(biāo)與正常對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05),在最后1次注射環(huán)磷酰胺2 h后處死所有小鼠,稱重,迅速剖取胸腺和脾臟組織,用濾紙吸去表面血液,在精密扭力天平上稱重,計(jì)算胸腺和脾臟質(zhì)量指數(shù)。

式(3)

式(4)

式中:m0:小鼠質(zhì)量,g;m1:胸腺組織質(zhì)量,g;m2:脾臟組織質(zhì)量,g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示(n=3)。采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

不同螯合pH對(duì)雞胚肽螯合率及螯合物得率的影響如圖1所示,在螯合pH為6～8時(shí),雞胚肽螯合率隨著pH的升高而迅速升高,在pH為8時(shí)最高;pH為8～10時(shí),螯合率隨著pH的升高而降低,這可能由于堿性環(huán)境下Zn(OH)2的生成爭(zhēng)奪了Zn2+或堿性條件抑制了肽的活性。螯合物得率在pH為10時(shí)最高,這也可能由于Zn(OH)2沉淀析出,導(dǎo)致螯合物得率虛高[15]。因此選擇pH7、8、9為響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)螯合pH的三個(gè)水平。

圖1 螯合pH對(duì)螯合率及螯合物得率的影響Fig.1 Effect of chelating pHon chelation rate and chelate yield

不同螯合溫度對(duì)雞胚肽螯合率及螯合物得率的影響如圖2所示,在50～70 ℃時(shí),雞胚肽螯合率及螯合物得率隨著螯合溫度的升高而迅速升高;在70 ℃時(shí)螯合率最高,可能隨著溫度的升高,反應(yīng)體系的分子運(yùn)動(dòng)加快,易于鋅離子螯合的氨基酸殘基和位點(diǎn)暴露出來(lái)[16],從而導(dǎo)致螯合率及螯合物得率的升高。螯合溫度為70～90 ℃,隨著螯合溫度增加,螯合率及螯合物得率逐步降低,可能高溫導(dǎo)致雞胚肽活性降低,或者生成的肽鋅螯合物結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定[17],從而導(dǎo)致螯合率及螯合物得率的降低。因此選擇60、70、80 ℃為響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)螯合溫度的三個(gè)水平。

圖2 螯合溫度對(duì)螯合率及螯合物得率的影響Fig.2 Effect of chelating temperatureon chelation rate and chelate yield

不同雞胚肽與鋅濃度比實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示,在1.0∶1～2.0∶1濃度比下,隨著雞胚肽與鋅濃度比的增加,螯合率及螯合物得率呈逐漸增加的態(tài)勢(shì);當(dāng)濃度比大于2.0∶1時(shí),螯合率及螯合物得率增長(zhǎng)趨勢(shì)不明顯,可能隨著濃度比的增長(zhǎng),鋅與雞胚肽的螯合作用逐漸飽和,過(guò)量的雞胚肽與鋅離子的螯合能力不斷減弱,故而螯合率及螯合物得率不再大幅增長(zhǎng)。因此,選擇1.5∶1、2.0∶1、2.5∶1為響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)雞胚肽與鋅濃度比的三個(gè)水平。

圖3 雞胚肽與鋅濃度比對(duì)螯合率及螯合物得率的影響Fig.3 Effect of concentration ratio of chicken embryopeptide to zinc on chelation rate and chelate yield

不同螯合時(shí)間實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示,當(dāng)螯合時(shí)間不斷增長(zhǎng)時(shí),螯合率及螯合物得率也在不斷逐漸增加,在2.5 h之前,螯合率及螯合物得率增加較快,此后再隨著時(shí)間的推移螯合率及螯合物得率變化不大,可能2.5 h時(shí),雞胚肽中易與鋅螯合的氨基酸殘基及位點(diǎn)基本飽和,所以螯合率及螯合物得率增長(zhǎng)極少,考慮到經(jīng)濟(jì)及效率等因素,縮短螯合時(shí)長(zhǎng),故選擇1.5、2.0、2.5 h為響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)螯合時(shí)間的三個(gè)水平。

圖4 螯合時(shí)間對(duì)螯合率及螯合物得率的影響Fig.4 Effect of chelating time onchelation rate and chelate yield

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取螯合pH(A)、螯合溫度(B)、雞胚肽與鋅濃度比(C)、螯合時(shí)間(D)為自變量,以螯合率(Y)為響應(yīng)值,根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)[18],實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface test

表3 螯合率回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of chelation rate regression equation

圖5 雙因素交互作用影響螯合率的等高線及三維曲面圖Fig.5 Contour line and three-dimensional surface map of two-factor interaction affecting chelation rate

2.2.2 最佳螯合條件的確定及驗(yàn)證 通過(guò)Design Expert V8.0.6.1分析得到以螯合率為指標(biāo)的最佳螯合條件為螯合pH8.04,螯合溫度70.98 ℃,肽鋅濃度比為2.31∶1,螯合時(shí)間2.19 h,此時(shí)的螯合率預(yù)測(cè)值為49.79%,結(jié)合實(shí)際操作及經(jīng)濟(jì)可行性,將螯合條件調(diào)整為pH8.0,螯合溫度70 ℃,肽鋅濃度比為2.3∶1,螯合時(shí)間2.2 h,在此條件進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn),測(cè)得螯合率為48.98%±0.35%,與預(yù)測(cè)值接近,其相對(duì)誤差為0.41%,說(shuō)明在此螯合條件下的回歸方程模型可靠。此時(shí)螯合物得率為38.04%±0.26%,得率較高且穩(wěn)定。

2.3 雞胚肽鋅螯合物免疫調(diào)節(jié)作用

當(dāng)機(jī)體含鋅總量下降時(shí),機(jī)體的免疫功能降低,免疫器官的重量會(huì)減少五分之一甚至五分之二[21]。免疫器官是抵抗外來(lái)有害物質(zhì)的基礎(chǔ),免疫器官受損會(huì)造成免疫功能細(xì)胞的減少及降低機(jī)體的免疫力,從而造成機(jī)體易感疾病[22]。因此,增加免疫器官的重量勢(shì)必對(duì)人體的免疫力有很大的提升,免疫器官-胸腺和脾臟質(zhì)量指數(shù)的變化能夠反映免疫調(diào)節(jié)方面的變化[23]。

由表4可以看出,模型組與正常對(duì)照組有顯著差異,說(shuō)明對(duì)模型對(duì)照組的小鼠注射環(huán)磷酰胺后,小鼠的胸腺質(zhì)量指數(shù)與脾臟質(zhì)量指數(shù)顯著(P<0.05)下降,這可以表明小鼠的胸腺和脾臟器官的發(fā)育受到了環(huán)磷酰胺的抑制作用,小鼠胸腺和脾臟的受損模型建模成功[24]。富鋅雞胚肽高劑量組與模型組有顯著(P<0.05)差異,說(shuō)明富鋅雞胚肽對(duì)于環(huán)磷酰胺注射液所造成的免疫器官的萎縮具有明顯的促生長(zhǎng)以及增重的作用,富鋅雞胚肽能夠使胸腺和脾臟的質(zhì)量指數(shù)增大,且隨著服用劑量的加大,質(zhì)量指數(shù)逐漸增加。在一定范圍內(nèi),富鋅雞胚肽具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能。

表4 雞胚肽鋅螯合物對(duì)小鼠免疫器官-胸腺、脾臟質(zhì)量指數(shù)的影響Table 4 Effect of chicken embryonic peptide zinc chelateon the immune index of thymus and spleen in mice

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以雞胚蛋為原料,先用堿性蛋白酶后用胰蛋白酶進(jìn)行酶解后制備雞胚肽。以螯合率及螯合物得率為指標(biāo),進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),再以螯合率為指標(biāo),利用響應(yīng)面法優(yōu)化制備雞胚肽鋅螯合物,得到的最優(yōu)螯合工藝為:螯合pH8,螯合溫度 70 ℃,雞胚肽與鋅的濃度比為2.3∶1,螯合時(shí)間2.2 h,此時(shí)的螯合率為48.98%±0.35%,螯合物得率為38.04%±0.26%,通過(guò)免疫器官-胸腺和脾臟影響研究發(fā)現(xiàn),適宜劑量的富鋅雞胚肽能使小鼠的胸腺和脾臟的質(zhì)量指數(shù)明顯增大,說(shuō)明通過(guò)雙酶酶解制備的雞胚小肽與鋅元素的螯合物具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能,并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。但本實(shí)驗(yàn)只針對(duì)機(jī)體免疫器官的重量進(jìn)行了考察,不能完全代替機(jī)體的免疫功能,淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程、發(fā)揮作用的階段及基因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面均是免疫的物質(zhì)基礎(chǔ)[25],因此全方位的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)才能證實(shí)雞胚肽-鋅螯合物對(duì)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的影響。由于實(shí)驗(yàn)水平及條件的限制,這些方面需進(jìn)一步的考察。