馬巖石,姜 明,李 慧,裴芳藝

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院科研處,齊齊哈爾 161000)

我國制醬工藝歷史悠久,歷經(jīng)多個朝代的發(fā)展,如今已經(jīng)普及到了韓國、日本、印度尼西亞等東南亞國家和地區(qū)。豆醬是以大豆為主材料,通過發(fā)酵制備而成的一種具有獨特風(fēng)味的食品以及調(diào)味品。東北作為我國大豆的主要產(chǎn)區(qū),其大豆年產(chǎn)量占全國總產(chǎn)量的50%左右,豆醬的制作也是非常普遍的[1]。

目前東北豆醬主要采用大豆發(fā)酵的方式進(jìn)行制作,制作過程中各種微生物作用賦予了豆醬獨特的風(fēng)味,因此明確東北豆醬成品中的微生物組成是十分必要的[2]。目前國內(nèi)對食品中微生物的研究在發(fā)酵過程中的風(fēng)味物質(zhì)檢測和重要微生物的鑒定方面已經(jīng)比較普遍[3-6],Yu等[7]對傳統(tǒng)農(nóng)家醬中細(xì)菌的生物胺含量進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)組胺和酪胺與發(fā)酵時間呈顯著正相關(guān)。齊欣[8]通過測定朝鮮族大醬中異黃酮提取物(IEOKSP)對幾種癌細(xì)胞增殖的影響等試驗得出，朝鮮族大醬中主要抗癌成分隨著貯藏時間的延長,含量逐漸增多。

高通量測序如今越來越多的應(yīng)用在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、食品、醫(yī)學(xué)等微生物多樣性的檢測中[9-12],谷靜思等[13]通過高通量測序的方法以及傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法對臭豆腐中的細(xì)菌的微生物群進(jìn)行分析,最終得到了臭豆腐中微生物群落的分布信息。Ercolini[14]介紹了高通量測序技術(shù)用于研究食品微生物群的當(dāng)前情景和未來前景,并描述了選擇最佳工作條件以滿足食品研究特定需求的決策過程。本研究采用高通量測序技術(shù)[15],以東北市場常見的5種豆醬成品為研究材料,選取比較適宜序列檢測的細(xì)菌16S rDNA V4區(qū)及真菌ITS1～2區(qū)[16-18]基因序列檢測其微生物群落結(jié)構(gòu),能夠更加全面、準(zhǔn)確的了解其菌群結(jié)構(gòu),為進(jìn)一步的豆醬的生產(chǎn)、保藏以及優(yōu)勢菌種的利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

5種豆醬FJ01、FJ02、CD01、CD02、CD03 均為發(fā)酵時間45 d的市售產(chǎn)品,分別來自東北地區(qū)5個不同的生產(chǎn)地點,FJ01產(chǎn)于遼寧營口,工業(yè)生產(chǎn),FJ02產(chǎn)于黑龍江綏化,工業(yè)生產(chǎn),CD01產(chǎn)于吉林通化,手工制作,CD02產(chǎn)于吉林白城,工業(yè)生產(chǎn),CD03產(chǎn)于哈爾濱,手工制作;DNA Marker5000、DNA Marker2000 上海生工生物工程有限公司;瓊脂糖 西班牙 Biowest Agarose;普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒DP209 天根生化科技(北京)有限公司;gold view II型核酸染色劑 Solarbiao;提取液等配制試劑 上海潤捷化學(xué)試劑有限公司。

ZS-F6-20恒溫水浴鍋 山東桑澤儀器儀表有限公司;MixPlus渦旋振蕩器 合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司;5415D高速離心機 德國eppendorf;超微量分光光度計 Thermo Nano Drop2000;DYCP-32A瓊脂糖水平電泳儀 北京六一儀器廠;T100 PCR儀、1708195 凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-rad。

1.2 實驗方法

1.2.1 豆醬總DNA提取 根據(jù)Zhu等[19]提取DNA的方法,略有修改。取待測的5個豆醬樣品各0.5 g裝于2 mL EP管中,離心去上清液,在沉淀內(nèi)加入0.75 mL提取緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl,pH9.0,40 mmol/L EDTA),0.15 mL 10% SDS和0.45 mL芐基氯,50 ℃水浴35 min,每5 min取出上下?lián)u動若干次,以保證提取物與試劑充分接觸。水浴結(jié)束后,加入0.45 mL 3 mol/L NaOAc在冰上處理15 min。最后,10000 r/min離心10 min后,使用異丙醇沉淀DNA,梯度酒精洗滌晾干后用ddH2O溶解。分別用1%的瓊脂糖電泳和超微量分光光度計檢測DNA片段大小及濃度,并將其稀釋至適宜的濃度[20],-20 ℃保存待用。

1.2.2 PCR擴增 以提取的豆醬總DNA為模板,細(xì)菌16S rDNA基因的V3～V4區(qū)通用擴增引物341F和806R[21],真菌ITS區(qū)通用擴增引物ITS3F和ITS4R[22-23](表1)為引物,結(jié)合高秀芝等[24]和Siddiqui等[25]的PCR反應(yīng)體系和程序進(jìn)行PCR反應(yīng)。

表1 PCR擴增引物信息表Table 1 Information of PCR amplification primer

PCR反應(yīng)體系(50 μL):10×PCR Buffer 5 μL,2 mmol/L dNTP mix 4 μL,45 pmol前后引物各5 unit/μL,Taq DNA聚合酶0.2 μL,DNA模板10 ng/μL 1 μL,ddH2O加至50 μL。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性30 s,48 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共35個循環(huán);72 ℃終延伸7 min。

1.2.3 電泳檢測及測序 通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物,并對目的片段進(jìn)行膠回收,將樣品交由北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

原始測序序列使用Trimmomatic(v 0.32)軟件對各樣品序列做質(zhì)控處理,利用軟件Usearch(V 7.0)去除非靶區(qū)域序列、嵌合體及短片段序列;利用FLASH軟件將測序得到的reads進(jìn)行組裝。在97%相似度條件下,按照序列間的距離對序列進(jìn)行聚類,得到用于物種分類的 OTU(Operational Taxonomic Unit)序列。利用MOUTHUR軟件進(jìn)行OTU分布統(tǒng)計分析以及聚類比對的分類學(xué)分析。計算ACE/Chao/Shannon/Simpson/Coverage。利用RDP classifer(v 2.2)軟件將OTU序列與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,獲得物種注釋,Excel 2007用以數(shù)據(jù)處理及分析統(tǒng)計作圖。

2 結(jié)果

2.1 豆醬總DNA提取結(jié)果

通過瓊脂糖凝膠電泳檢測可知,5個樣品在大于5000 bp處均獲得目的條帶,且條帶清晰,說明豆醬總DNA提取成功,經(jīng)超微量分光光度計檢測可知基因組DNA的濃度及純度OD260/OD280均在1.75～2.10的范圍內(nèi),證明DNA純度較好,沒有污染,可用于后續(xù)的PCR擴增。

2.2 測序序列長度與分布

通過高通量測序結(jié)果可知,本研究五份豆醬樣本中細(xì)菌(表2)共測得序列134115條,其中樣本細(xì)菌長度分布在460～469 bp之間,通過過濾篩除低質(zhì)量序列[26],得到有效序列共131462條,長度分布在427～430 bp之間;五份豆醬樣本真菌(表3)共得到序列124301條,長度在332～350 bp范圍內(nèi),得到有效序列120336條,長度309～312 bp范圍內(nèi)。

表2 細(xì)菌序列信息Table 2 Bacterial sequence information

表3 真菌序列信息Table 3 Fungus sequence information

2.3 樣品的OTU統(tǒng)計及分析

通過對序列結(jié)果隨機抽樣,統(tǒng)計序列數(shù)變化與OTU變化,從一個樣本測序得到的所有序列中隨機抽取序列(reads),統(tǒng)計每次抽取出來的序列有多少OUT(代表了有多少物種),最后以抽取的序列數(shù)目為橫坐標(biāo),相應(yīng)的OUT數(shù)目為縱坐標(biāo),繪制曲線圖1,隨著序列數(shù)增大，幾個樣品的曲線逐漸接近平行,即更大的序列不會導(dǎo)致OUT數(shù)目的顯著性增長,證明以目前的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析是比較可靠的。

圖1 樣品稀釋性曲線Fig.1 Dilution curve of sample注:A:樣品中細(xì)菌OTU;B:樣品中真菌OUT。

采用OUT統(tǒng)計工具bioinformatics.psb.ugent.be-Venn,將幾個樣本的測序結(jié)果按照操作提示錄入工具中,然后分別對測序結(jié)果篩選出來的細(xì)菌真菌有效序列進(jìn)行聚類,如圖2,樣品細(xì)菌在OTU聚類后共得到1732個OTU,其中有38個OTU是個樣品共有的,樣品FJ01特有333個OUT,FJ02特有193個OTU,CD01有117個,CD02有132個,CD03有190個。樣品真菌得到1040個OTU,共有OTU為18個。樣品FIJ01特有342個OTU,FJ02特有54個OTU,CD01有13個,CD02有41個,CD03有62個。

圖2 樣品OTU分布韋恩圖Fig.2 Venn diagram of the sample OTUs distribution注:A:樣品中細(xì)菌OTU;B:樣品中真菌OUT。

2.4 群落多樣性分析

由表4可知,本研究5個樣品共得到細(xì)菌OUT 1732個,其中FJ01細(xì)菌樣品最多,達(dá)到535個。CD02細(xì)菌最少,有267個。真菌OUT 1040個,其中FJ01樣品最多,有515個。CD03真菌最少,僅111個。細(xì)菌總體數(shù)量和種類高于真菌,說明在豆醬成品當(dāng)中,細(xì)菌占據(jù)微生物群落的主導(dǎo)地位。所有試驗樣品的OUT覆蓋率(Coverage)均大于99%,即表明本次試驗建立的文庫能夠較準(zhǔn)確地反映出待測樣品的微生物多樣性情況。Chao、ACE指數(shù)用于計算菌群豐度(community richness),二者指數(shù)越大,說明群落豐富度越高的理論[27-28]。本試驗細(xì)菌的Chao和ACE指數(shù)均大于真菌,說明試驗樣品中的細(xì)菌群落豐富度大于真菌群落;Shannon、Simpson用于計算菌群多樣性(community diversity)指數(shù),Shannon的值越大,說明群落多樣性越高,Simpson指數(shù)值越大,則說明其群落多樣性越低[29],因此結(jié)合表4中Simpson和Shannon指數(shù),五種豆醬細(xì)菌多樣性水平應(yīng)該是CD01最高,CD02次之,CD03高于FJ01,最低的是FJ02;真菌多樣性水平上,CD01遠(yuǎn)高于其他幾個品種,這應(yīng)該源于其生產(chǎn)方式,CD01屬于手工自制醬,對滅菌做得不如工業(yè)生產(chǎn)。

表4 豆醬微生物群落多樣性Table 4 Microbial community diversity in soy sause

2.5 群落組成

2.5.1 樣品微生物在門上的分布 通過對五個樣品的測序結(jié)果分析可知,樣品中共有17個細(xì)菌門被檢出,其種類豐富度較高,所占總序列數(shù)差異大,厚壁菌門(Firmicutes)和變形桿菌門(Proteobacteria)是主要的菌門。由圖3A可得,厚壁菌門(Firmicutes)在樣品FJ01、CD02、CD03中屬于優(yōu)勢菌門,分別占總數(shù)的85%、79%、92%。變形桿菌門(Proteobacteria)是樣品FJ02和CD01中的優(yōu)勢菌門,各占總數(shù)的79%和78%。除優(yōu)勢菌門以外還發(fā)現(xiàn)有以放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)為主的其他菌門,但各自在樣品中的總占比均較低。

樣品在真菌中檢測出豐富的菌門有子囊菌門(Ascomycota),比較豐富的有擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、接合菌門(Zygomycota),以及其他菌門。從圖3B中可以看出,子囊菌門(Ascomycota)幾乎是所有樣品的優(yōu)勢菌門,分別占總數(shù)的99%、98%、70%、98%、90%。樣品CD01中擔(dān)子菌門所占比例也達(dá)到了近20%。

圖3 樣品在門上的分布情況Fig.3 Distribution of samples at the phylum level注:A:樣品中細(xì)菌群落分布;B:樣品中真菌群落分布。

2.5.2 樣品微生物在屬上的分布 在屬的水平上,樣品共檢出39個細(xì)菌屬。如圖4A所示,樣品FJ01和樣品CD03中的優(yōu)勢菌屬是葡萄球菌屬(Staphylococcus),占各自總數(shù)的69%和64%。腸桿菌屬(Enterobacter)在FJ01和CD03中也分別占到總數(shù)的19%和11%;在樣品CD01中,腸桿菌屬(Enterobacter)占到了總數(shù)的53%,乳酸桿菌屬(Lactobacillus)占總數(shù)的20%,明串珠菌也達(dá)到了16%;FJ02中的優(yōu)勢菌群為芽孢桿菌屬(Bacillus),其豐度達(dá)到了45%,色鹽桿菌屬(Chromohalobacter)32%,葡萄球菌屬為7%;CD02中乳酸桿菌與腸桿菌屬分別占到了總數(shù)的22%和20%,腸球菌占到了30%;魏斯氏菌屬(Weissella)在除CD03以外中均有占到3%以上。腸桿菌、乳酸桿菌、色鹽桿菌為5個樣品共有細(xì)菌,各個樣品間微生物群落豐度差距很大,這可能與幾種材料產(chǎn)自不同地區(qū)有關(guān)。此外各樣品中相對豐度大于1%的還有雙歧桿菌(Bifidobacterium)、雷爾氏菌屬(Ralstonia)、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)。

樣品中共檢測出43個真菌屬,如圖4B所示各樣品間的優(yōu)勢菌的種類和數(shù)量同樣差異顯著,曲霉屬、接合霉屬、赤霉屬、毛霉屬為5個樣品共有的真菌屬,但豐度上差異明顯。FJ01中的優(yōu)勢真菌是接合酵母屬,序列豐度為70%,FJ02、CD01、CD02、CD03 中該菌屬的序列豐度分別為10%、18%、30%、11%,可見接合酵母屬在幾個材料的真菌中數(shù)量都相對比較豐富。在 FJ02中相對豐度最高的真菌屬為曲霉屬。FJ02、CD02、CD03中均含有德巴利氏酵母屬(Debaryomyces)。CD02中菌屬種類多,分布比較均勻都在10%～30%左右,因此其優(yōu)勢并不能判定其優(yōu)勢均屬。CD03中優(yōu)勢菌屬十分明顯,屬于赤霉菌屬,占到了60%。

圖4 樣品在屬上的分布情況Fig.4 Distribution of samples on genus level注:E:樣品中細(xì)菌群落分布;F:樣品中真菌群落分布。

3 討論

本研究采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對東北不同產(chǎn)地的5份豆醬進(jìn)行高通量測序,檢測到豆醬食品中含有數(shù)量龐大的真菌和細(xì)菌微生物群體,包括葡萄球菌、乳酸桿菌、德巴利氏酵母屬、芽孢桿菌等大量的發(fā)酵食品優(yōu)勢菌屬。焦玉[30]通過對火腿腸的風(fēng)味物質(zhì)以及微生物檢測中就發(fā)現(xiàn),葡萄球菌是一類可以通過水解脂肪從而提高發(fā)酵香腸中游離脂肪酸的含量,促進(jìn)脂肪分解的優(yōu)勢菌屬;樣品FJ01和CD03的葡萄球菌占比均超過60%。袁鈺等[31]通過高通量測序?qū)Ρ本┒怪瓋旱奈⑸锒鄻有院凸δ苎芯浚舶l(fā)現(xiàn)了乳酸桿菌在對豆汁兒中的氨基酸代謝具有重要作用,益于腸道菌群健康發(fā)酵;在糟魚發(fā)酵過程中,芽孢桿菌、乳酸桿菌具有產(chǎn)蛋白酶和脂肪酶的特性,酵母菌具有產(chǎn)脂肪酶的特性,能夠更好的促進(jìn)發(fā)酵品質(zhì)以及風(fēng)味被李改燕[32]證實。

研究中對豆醬微生物群落結(jié)構(gòu)分析后，發(fā)現(xiàn)幾種樣品的細(xì)菌真菌多樣性在門和屬的水平上均呈現(xiàn)出較大的差異,說明在豆醬生產(chǎn)中其微生物多樣性可能受到地域的影響,同時也很好的解釋了造成不同地區(qū)生產(chǎn)的豆醬風(fēng)味差異的一部分原因是豆醬內(nèi)部微生物的差異;不同加工方式對于豆醬中微生物多樣性的影響也存在較大影響,例如實驗中手工制作的豆醬CD01，或許因為在滅菌過程中處理得并不徹底而導(dǎo)致真菌多樣性相對幾種工業(yè)醬有顯著的差距,其中不乏有對人體有害的菌類;此外實驗結(jié)果對了解豆醬中微生物群落組成和微生物多樣性能夠提供一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。在今后地方特色的豆醬生產(chǎn)、保藏以及優(yōu)勢菌種選育中,可以參考本研究中的各個樣品的試驗結(jié)果,來針對不同產(chǎn)地以及發(fā)酵天數(shù)的豆醬中優(yōu)勢菌屬進(jìn)行生產(chǎn)處理,以達(dá)到最佳的效果。