高熳熳,焦新雅,張志勝,淑 英,饒偉麗,程書梅

(河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院,河北保定 071001)

發(fā)酵肉制品是以各類畜禽肉為原料,采用微生物發(fā)酵技術,原料肉經(jīng)特定的微生物作用,產(chǎn)酸使pH下降,并經(jīng)過低溫失水使產(chǎn)品的AW降低,從而延長產(chǎn)品貯藏期的一大類肉制品[1-2]。近年來,發(fā)酵肉制品因其具有獨特的感官性質和豐富的營養(yǎng)價值,并且有利于消化吸收,貨架期較長等優(yōu)點,越來越受廣大人民的歡迎。但由于其生產(chǎn)周期長,工業(yè)化生產(chǎn)的規(guī)模受到限制,價格昂貴,不能滿足日益增長的市場需求[3]。因此,篩選用于發(fā)酵肉制品的乳酸菌株,對于縮短發(fā)酵肉制品生產(chǎn)周期,實現(xiàn)商業(yè)化具有重要意義。

侗族是中國少數(shù)民族之一,其制作的傳統(tǒng)發(fā)酵酸肉營養(yǎng)豐富,風味獨特,保存期長[4-5]。而乳酸菌在其自然發(fā)酵過程中發(fā)揮了重要作用,一方面它能將原料中的碳水化合物分解為乳酸,使產(chǎn)品的pH下降,有效抑制雜菌的生長[6-8];另一方面,它賦予了產(chǎn)品特有的風味、色澤和質地,因此其常被篩選出來用作肉品發(fā)酵劑[9]。例如章德法等人在侗族酸肉中篩選出兩株戊糖片球菌,一株德氏乳桿菌和一株米酒乳桿菌[10];董競等人在侗族酸肉中篩選出兩株肉葡萄球菌[4]。而從侗族酸肉中篩選出香腸乳桿菌較為少見。

乳酸菌是益生菌中應用最為廣泛的菌種之一。大量文獻證明,使用乳酸菌進行發(fā)酵是可行的,安全的。但也有少量研究結果表明能夠從心內(nèi)膜炎患者[11-12]、敗血癥[13-14]、肝膿腫[15-16]和尿路感染病人體內(nèi)分離出乳酸菌,因此對新篩選出的可作為益生菌的乳酸菌進行安全性的評價是必要的,尤其是對于食品用的菌株[17]。

在益生菌的安全性評價中,一個非常重要的方面就是耐藥性,研究認為乳酸菌中絕大多數(shù)的抗生素耐藥性是一種非轉移特性,然而與結合質粒和轉座子相關的耐藥性因子有可能引起耐藥性在腸道菌群之間相互轉移。因此,對于食品用乳酸菌進行質粒檢測可有效減低菌株作為耐藥性基因貯存宿主的風險;溶血現(xiàn)象的發(fā)生可能是由于溶血性細菌引起的,乳酸菌有可能是潛在的溶血性細菌,導致敗血癥的發(fā)生。

本試驗從侗族傳統(tǒng)發(fā)酵酸肉中分離純化得到乳酸菌菌株,并從中選出適合發(fā)酵肉類生產(chǎn)的優(yōu)良菌種,進行細胞形態(tài)學觀察以及16S rRNA遺傳學鑒定,對其發(fā)酵特性和生長特性以及其安全性進行評估,以期為新型健康發(fā)酵肉制品的研究和開發(fā)提供優(yōu)質菌種資源[18]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

侗族傳統(tǒng)發(fā)酵酸肉 保定大賣園超市(河北農(nóng)業(yè)大學店);31516KC4細菌基因組DNA提取試劑盒 美國AXYGEN公司;RR001EX Taq酶、BK6501AdNTP、AB5401A10×EX Taq Buffer 大連TaKaRa公司;引物 生工生物工程上海(股份)有限公司;DL2000 Marker 北京博邁德生物技術有限公司;頭孢噻肟(Cefotaxime)、頭孢氨芐(Cephalexin)、氨卡西林(Ampicillin)、卡那霉素(Kanamycin)、慶大霉素(Gentamycin)、新霉素(Neomycin)、鏈霉素(Streptomycin)、四環(huán)素(Tetracycline)、紅霉素(Erythromycin)、萬古霉素(Vancomycin)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin)、左氧氟沙星(Evofloxacin)、阿莫西林(Amoxicillin) 深圳康泰生物制品股份有限公司;血平板 廣東環(huán)凱生物科技有限公司;質粒提取試劑盒(Easy Pure Plasmid Miniprep Kit) 北京全式金生物技術有限公司。

SW-CJ-1FD潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;LD5-2A低速離心機 北京京立離心機有限公司;FA2204B電子天平 上海天美天平儀器有限公司;1-15PK高速離心機 德國西格瑪公司;XZQ-X300數(shù)顯振蕩培養(yǎng)箱 常州中捷實驗儀器制造有限公司;Nikon YS100顯微鏡 尼康映像儀器銷售(中國)有限公司;JY04S-3C凝膠成像儀、JY300C電泳系統(tǒng) 北京君意東方電泳設備有限公司;MG96+PCR儀 杭州朗基科學儀器有限公司;625-0020 3730XL 測序儀 Applied Biosystems。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 MRS培養(yǎng)基、產(chǎn)粘性培養(yǎng)基、耐鹽性試驗培養(yǎng)基、耐硝性試驗培養(yǎng)基、產(chǎn)H2S培養(yǎng)基、葡萄糖產(chǎn)氣培養(yǎng)基、氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基、硝酸鹽還原培養(yǎng)基、產(chǎn)氨培養(yǎng)基、乳酸紙層析試劑、石蕊牛乳培養(yǎng)基、V-P反應培養(yǎng)基參考文獻[18-21]進行配制。

1.2.2 樣品處理 在無菌條件下取侗族酸肉樣品25 g,切碎,加入到225 mL的無菌生理鹽水中,振蕩均勻備用。取1.0 mL加至到9.0 mL無菌生理鹽水中進行梯度稀釋。

1.2.3 乳酸菌的分離 選取合適的稀釋度,涂布于含3% CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基上,凝固后置于37 ℃培養(yǎng)。挑取產(chǎn)生碳酸鈣溶解圈的單菌落反復劃線,直至獲得純的菌株。對純菌株進行革蘭氏染色、菌體形態(tài)觀察、過氧化氫酶活性測定,凡是革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶試驗陰性的菌株初步確定為乳酸菌[22-23]。

1.2.4 優(yōu)良乳酸菌的篩選 對分離得到的乳酸菌按照以下方法進行篩選:產(chǎn)黏性試驗、耐鹽性試驗、耐硝性試驗、產(chǎn)H2S試驗、發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣試驗、氨基酸脫羧酶試驗、硝酸鹽還原能力試驗、產(chǎn)氨試驗、乳酸的紙層析分析、石蕊牛乳試驗、V-P試驗、產(chǎn)酸性試驗、抑菌試驗、蛋白酶活性檢測和脂肪酶活性檢測參考湛劍龍等[24-27]。

1.2.5 乳酸菌的鑒定

1.2.5.1 形態(tài)特征觀察 將純化好的菌株利用平板劃線的方法接種于MRS培養(yǎng)基平板上,在37 ℃條件下恒溫培養(yǎng),觀察并記錄菌株的菌落形態(tài)。對菌株進行革蘭氏染色,在光學顯微鏡下油鏡觀察并記錄待測菌株的菌體形態(tài)特征[28]。

1.2.5.2 生化鑒定 將分離得到的菌株于MRS液體培養(yǎng)基中活化后,按照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[29]和《伯杰細菌鑒定手冊》[30]等文獻上的試驗方法接入生化鑒定管,18～72 h后觀察記錄現(xiàn)象。

1.2.5.3 分子生物學鑒定 DNA的提取:分別用細菌基因組DNA提取試劑盒對分離純化的細菌進行提取,提取步驟按試劑盒說明書進行。PCR擴增及測序:PCR反應體系(50 μL):10×Ex Taq buffer 5.0 μL,2.5 mmol/L dNTP Mix 4.0 μL,10p Primer 1 2.0 μL,10p Primer 22.0 μL,5u Ex Taq 0.5 μL,Template 2.0 μL,ddH2O 36.5 μL;反應條件:94 ℃預變性3 min,94 ℃變性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s(24次循環(huán))。PCR擴增產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,120 V,20 min,恒壓對PCR產(chǎn)物進行電泳,并在凝膠成像系統(tǒng)下觀察,并照相分析。將PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行純化和測序。

序列分析:測序結果在NCBI利用Blast做相似性比對分析;另外,用ContigExpress軟件對序列進行拼接及人工校正,生成Fasta格式文件,利用Mega 7軟件按照Neighbor-Joining法聚類構建系統(tǒng)發(fā)育樹。對得到的菌株進行16S rRNA分子鑒定,鑒定委托生工生物工程(上海)有限公司完成。

1.2.6 菌株產(chǎn)酸能力和生長曲線的測定 將分離菌株活化后接種于MRS液體培養(yǎng)基中,以空白培養(yǎng)基作對照,每隔2 h用分光光度計測定600 nm波長下各菌株菌液的OD值,并用酸度計測定pH。其OD值大小表示菌株的生長情況,pH可反應出菌株的產(chǎn)酸能力。

1.2.7 菌株安全性分析

1.2.7.1 抗生素敏感性試驗 本實驗采用藥敏紙片(直徑6.0 mm)瓊脂擴散法[31],使用渦旋混勻器混勻實驗菌液,各取100 μL菌液涂布于MRS固體培養(yǎng)基上,待菌液被培養(yǎng)基完全吸收后,將藥敏紙片放于培養(yǎng)基上,靜置15 min后,倒置放于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h,測量并記錄各藥敏紙片的抑菌圈直徑大小。結果判定參照《CLSI 抗菌藥物敏感性試驗標準》。

1.2.7.2 質粒提取 參照質粒提取試劑盒使用說明[32]。

1.2.7.3 溶血試驗 將活化好的實驗菌液劃線于血平板培養(yǎng)基上,倒置放于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,觀察是否出現(xiàn)溶血現(xiàn)象[33]。

1.2.8 三株菌的拮抗試驗 將S26菌株在MRS固體培養(yǎng)基上劃一直線接菌,待長出菌落后,沿菌落邊緣(不接觸)從垂直方向接S42,37 ℃條件下培養(yǎng)24 h,觀察S26對于S42的抑制效果。同理,檢測S26對S53的抑制效果[34]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個實驗重復3次,取平均值。采用Excel 2017軟件進行繪圖和數(shù)據(jù)處理,SPSS 19.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的初步分離純化

采用CaCO3-MRS固體培養(yǎng)基進行乳酸菌的初步篩選,挑取具有明顯溶鈣圈的菌落進行反復純化,在經(jīng)革蘭染色以及過氧化氫酶活性測定后,得到G+、過氧化氫酶試驗陰性的疑似乳酸菌共54株,分別命名為S1～S54。

2.2 優(yōu)良乳酸菌株的篩選結果

對初篩得到的54株乳酸菌按照以下標準進行復篩:能夠耐受6%的NaCl和150 mg/kg NaNO2、不產(chǎn)粘液、發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)氣、不產(chǎn)H2S、不產(chǎn)氨、不具有氨基酸脫羧酶活性,產(chǎn)酸速度快,發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)物主要為乳酸,能抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌[26]等,其結果見表1。

表1 乳酸菌主要發(fā)酵特性陽性菌數(shù)Table 1 Number of positive fermentation characteristics of lactic acid bacteria

由表1可知,絕大部分菌株能耐受高濃度的NaCl和亞硝酸鹽;只有一株菌產(chǎn)粘液(1.85%);大部分能使牛奶酸凝(88%);54株乳酸菌都產(chǎn)酸,發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)氣,不生成H2S;大部分菌株不會發(fā)生氨基酸脫羧反應(52%);多數(shù)菌株V-P反應陽性(74%);大約一半菌株可抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長。最終結果表明,菌株S26、S42、S53能夠滿足所有篩選條件,且產(chǎn)酸性能較好,可以作為肉品發(fā)酵的備選菌株。

2.3 乳酸菌菌株鑒定

2.3.1 形態(tài)學特征 從侗族傳統(tǒng)發(fā)酵酸肉中分離得到符合發(fā)酵條件的三株乳酸菌。其菌落形態(tài)和經(jīng)革蘭氏染色后的顯微形態(tài)詳見表2和圖1。

表2 三株菌的形態(tài)學特征Table 2 Morphological characteristics of three strains

圖1 菌株S26、S42、S53革蘭氏染色顯微形態(tài)Fig.1 Gram staining micromorphology of strains S26,S42,S53

由表2和圖1可知,菌株S26為長桿菌,革蘭氏陽性,菌落呈乳黃色,扁平狀,菌落較小;菌株S42為短桿菌,革蘭氏陽性,菌落為乳白色,表面光滑,邊緣整齊;菌株S53為球形,菌落為乳白色,表面凸起,邊緣圓整。

2.3.2 生理生化結果 表3為三株菌的生理生化鑒定結果,結合三株菌的形態(tài)特征,根據(jù)文獻[30-31],可初步鑒定S26為香腸乳桿菌,S42為植物乳桿菌,S53為乳酸片球菌。

表3 生理生化鑒定結果Table 3 Physiological and biochemical identification results

2.3.3 乳酸菌菌株的16S rRNA序列測定及系統(tǒng)進化樹的構建 對提取菌株的總DNA進行PCR擴增,擴增出3條大小約為1500 bp的特異性條帶。然后將獲得的特異性片段純化后進行測序,并將測序結果用BLAST軟件在GenBank中進行序列同源性比對,將GenBank中與菌株序列同源性高于98%的幾株菌株進行BLAST分析,構建系統(tǒng)發(fā)育樹。結果如圖2～圖5所示,S26為香腸乳桿菌(Lactobacillusfarciminis),S42為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum),S53為乳酸片球菌(Pediococcuslactis)。

圖2 菌株的16S rRNA PCR擴增產(chǎn)物電泳條帶Fig.2 16S rRNA PCR amplification productelectrophoresis band of the strain注:1:Marker標記物;2～4:分別為菌株S26,S42,S53。

圖3 菌株S26系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain S26

圖4 菌株S42系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain S42

圖5 菌株S53系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of strain S53

2.4 菌株產(chǎn)酸能力和生長曲線的測定

將3株菌活化后接入到MRS培養(yǎng)基中,每間隔2 h取少量菌懸液,適當稀釋后測定其OD值,同時測定其pH的變化規(guī)律,再分別繪制三株菌的生長曲線及pH變化曲線,圖6、圖7和圖8分別為香腸乳桿菌S26、植物乳桿菌S42、乳酸片球菌S53的生長曲線及pH變化曲線。

由圖6、圖7和圖8可知,3株菌的生長延滯期均為0～3 h,此時菌種處于適應階段,生長緩慢;而香腸乳桿菌S26的對數(shù)生長期為3～10 h,植物乳桿菌S42的對數(shù)生長期為3～12 h,乳酸片球菌S53的對數(shù)生長期為3～16 h,此時菌種增殖較快;對于穩(wěn)定期,香腸乳桿菌S26在10 h后菌種進入穩(wěn)定時期,植物乳桿菌S42在12 h后菌種進入穩(wěn)定時期,乳酸片球菌S53在16 h后菌種進入穩(wěn)定時期,此時OD值緩慢增長至最大并保持穩(wěn)定狀態(tài)。三株菌的pH均在對數(shù)生長期內(nèi)由5.7迅速下降至3.5左右,進入穩(wěn)定期后變化不大。

圖6 香腸乳桿菌S26生長曲線及pH變化曲線Fig.6 Lactobacillus farciminis S26 growth curve and pH curve

圖7 植物乳桿菌S42生長曲線及pH變化曲線Fig.7 Lactobacillus plantarum S42 growth curve and pH curve

圖8 乳酸片球菌S53生長曲線及pH變化曲線Fig.8 Growth curve and pH curve of Pediococcus lactis S53

2.5 菌株的安全性分析

2.5.1 抗生素敏感性試驗 采用藥敏片法檢測從酸肉中分離到的三株乳酸菌對13種抗生素的敏感性。被測菌株對抗生素的敏感性檢測結果如表4所示,香腸乳桿菌S26對這幾類抗生素均表現(xiàn)出敏感性;植物乳桿菌S42對糖肽類抗生素中的萬古霉素表現(xiàn)為耐藥,對其他類抗生素均有敏感性;乳酸片球菌S53對氨基糖苷類中的卡那霉素和喹諾酮類中的環(huán)丙沙星表現(xiàn)為耐藥,對其他抗生素均有敏感性。

表4 乳酸菌對13種抗生素的敏感性檢測結果Table 4 Sensitivity test results of lacticacid bacteria against 13 antibiotics

2.5.2 質粒提取 通過瓊脂糖凝膠電泳對S26、S42和S53做質粒檢測,同時以含有質粒的菌株(pET-22b)作對照,結果如圖9所示,對照菌株所在泳道出現(xiàn)熒光條帶,而被測菌株所在泳道均未出現(xiàn)熒光條帶,可認定3株菌不含有質粒。

圖9 質粒提取試驗結果Fig.9 Plasmid extraction test results

2.5.3 溶血現(xiàn)象 溶血性是體外對菌株進行安全性檢測的重要指標之一。根據(jù)溶血特征可將溶血性分為兩類:α溶血,特點是菌落周圍有草綠色溶血圈,對人致病力差;β溶血,其特點是菌落周圍出現(xiàn)透明溶血圈,對人體致病力強[35]。若無溶血性,則沒有溶血圈出現(xiàn)。由圖10可知,S26、S42和S53均無溶血現(xiàn)象產(chǎn)生,說明3株菌均不具有溶血性。

圖10 S26、S42和S53溶血試驗結果Fig.10 S26,S42 and S53 hemolysis test results

2.6 菌株之間的拮抗試驗

通過平板劃線可以比較菌株之間是否具有拮抗性,從而判斷菌株是否可以混合使用,由表5可知,S26、S42和S53之間均無拮抗性,可用來復配發(fā)酵。

表5 株菌拮抗效果比較Table 5 Comparison of antagonistic effects of strains

注:+代表拮抗,-代表不拮抗,/表示同種菌株不需要進行拮抗性測試。

3 結論

從傳統(tǒng)侗族酸肉中篩選出能夠產(chǎn)生明顯透明鈣圈、革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性的54株菌株,按照肉類發(fā)酵劑的篩選標準進一步篩選得到3株發(fā)酵性能較好的菌株,并對其進行分析鑒定,確定S26為香腸乳桿菌,S42為植物乳桿菌,S53為乳酸片球菌;對這3株菌的生長特性和產(chǎn)酸能力進行研究,發(fā)現(xiàn)這3株菌生長狀況良好,在12 h左右均能到達穩(wěn)定期,并且其產(chǎn)酸速度快,24 h內(nèi)可以將pH降到3.5左右;同時對這3株菌進行了安全性方面的評估,發(fā)現(xiàn)其對大多數(shù)抗生素無耐藥性,無質粒,也無溶血現(xiàn)象,安全性良好。這一研究結果將為肉制品以及功能性食品的研制等方面提供菌種資源。

本研究從傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中篩選出三株肉品發(fā)酵劑,其中香腸乳桿菌在肉品發(fā)酵劑方面未見報道;對這3株菌的具體功能方面應在今后進行更深一步的研究;此外,對這3株菌的發(fā)酵性能還應實際應用到肉制品發(fā)酵中進行進一步探究。