杜卿卿,彭增起,任曉鏷,黃楊斌,張雅瑋

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,江蘇南京 210095)

美拉德反應(yīng)過(guò)程可以產(chǎn)生大量的風(fēng)味物質(zhì)。Kwon等[1]將250 g牛肉加入5 L水中,450 ℃下加熱1 h,再文火加熱1 h制備牛肉湯,然后將木糖和谷胱甘肽在中性條件下150 ℃加熱120 min后加入牛肉湯中,與同樣條件下的葡萄糖和果糖相比,其牛肉湯的硫刺鼻味較淡,香氣更濃。蛋白酶解產(chǎn)物的美拉德反應(yīng)也會(huì)對(duì)烤肉香氣產(chǎn)生一定的影響。Kang等[2]將碎牛肉在85 ℃下水煮10 min,冷卻后加入蛋白酶和風(fēng)味酶,制備出牛肉酶解產(chǎn)物。木糖與酶解產(chǎn)物在pH6.5、125 ℃加熱2 h獲得的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有濃郁的烤牛肉風(fēng)味。Liu等[3]研究表明,pH為6.5時(shí),木糖和雞肉酶解產(chǎn)物在120～140 ℃獲得的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物比80～100 ℃具有的烤雞肉風(fēng)味更濃。然而,高溫加熱產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)的同時(shí),也會(huì)產(chǎn)生大量的雜環(huán)胺等危害人類身體健康的物質(zhì)。Shin等[4]發(fā)現(xiàn),苯丙氨酸、肌酐和葡萄糖在180 ℃下反應(yīng)30 min產(chǎn)生2-氨基-3-甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉(IQx)、2-氨基-3,4-二甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉(MeIQx)和2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并[4,5-b]吡啶(PhIP);呂慧超等[5]發(fā)現(xiàn)葡萄糖-肌酸酐-甘氨酸模型體系,130 ℃加熱1.5 h產(chǎn)生2-氨基-3,4-二甲基咪唑并[4,5-f]喹啉(MeIQ)。Linghu等[6]指出,180 ℃反應(yīng)1 h,色氨酸和賴氨酸可以顯著抑制葡萄糖-肌酐-苯丙氨酸模型中PhIP的形成,而對(duì)其風(fēng)味特性未做研究。但是,繼續(xù)降低美拉德反應(yīng)模型的溫度,能否既產(chǎn)生理想烤肉香氣又能抑制雜環(huán)胺形成,此方面的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

因此,本研究以牛肉湯提取物為原料,通過(guò)添加不同質(zhì)量濃度的木糖和半胱氨酸獲得美拉德反應(yīng)模型,以反應(yīng)液的OD值和感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo),探究不同質(zhì)量濃度下木糖和半胱氨酸在pH7、110 ℃加熱70 min對(duì)美拉德反應(yīng)模型的影響,并測(cè)定最優(yōu)組中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和雜環(huán)胺的種類和含量,以期獲得較低溫度下既具有理想的烤牛肉風(fēng)味,又含有較少雜環(huán)胺的美拉德反應(yīng)模型。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛背部最長(zhǎng)肌 南京蘇果超市;D-木糖、L-半胱氨酸 食品級(jí),無(wú)錫寧維生物科技有限公司;甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸(Gly-Gly-Tyr-Arg)標(biāo)準(zhǔn)品、12種雜環(huán)胺標(biāo)準(zhǔn)品:PhIP、2-氨基-3-甲基咪唑并[4,5-f]喹啉(IQ)、MeIQ、2-氨基-3,8-二甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉(8-MeIQx)、2-氨基-3,7,8-三甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉(7,8-DiMeIQx)、2-氨基-3,4,8-三甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉(4,8-DiMeIQx)、2-氨基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚(AaC)、2-氨基-3-甲基9H-吡啶并[2,3-b]吲哚(MeAaC)、1-甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚(Harman)、9H-吡啶并[3,4-b]吲哚(Norharman)、3-氨基-1,4-二甲基-5H-吡啶并[4,3-b]吲哚(Trp-P-1)和3-氨基-1-甲基-5H-吡啶并[4,3-b]吲哚(Trp-P-2) Sigma公司

T25高速勻漿機(jī) 德國(guó)IKA公司;Allegra 64R型高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman Coulter公司;日立L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本日立有限公司;M2e型多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)MD公司;Bruker 320-MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Bruker Daltonics公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牛肉湯提取物的制備 牛肉湯提取物的制備方法參照Liu[3]的方法,并做修改。選取牛背部最長(zhǎng)肌,用絞肉機(jī)絞成肉糜。取100 g,加入等體積的去離子水勻漿,調(diào)節(jié)pH至6.5,50 ℃下加熱60 min,然后在95 ℃下分別水浴加熱30、50、70 min。冷卻后,4 ℃離心10 min,轉(zhuǎn)速為10000 r/min。取上清液,獲得牛肉湯提取物,并測(cè)定其還原糖、氨基酸和多肽含量,每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.1.1 牛肉湯提取物中還原糖含量的測(cè)定 牛肉湯提取物中還原糖含量的測(cè)定按照GB5009.7-2016《食品中還原糖的測(cè)定》直接滴定法[7]進(jìn)行。

1.2.1.2 牛肉湯提取物中氨基酸含量的測(cè)定 牛肉湯提取物中氨基酸的測(cè)定參照GB 5009.124-2016 中《食品中氨基酸的測(cè)定》[8]。

1.2.1.3 牛肉湯提取物中多肽含量的測(cè)定 牛肉湯提取物中多肽含量的測(cè)定參照魯偉等[9]的方法并稍作修改,2.5 mL樣品溶液與等體積的10%(W/V)的三氯乙酸水溶液混合,靜置10 min;4000 r/min離心15 min;將上清液轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中,用5%的三氯乙酸定容;取0.9與0.6 mL雙縮脲試劑混合,靜置10 min;2000 r/min離心10 min,取上清液測(cè)定540 nm處的OD值。用5%的三氯乙酸依次配制0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6和1.8 mg/mL的Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標(biāo)準(zhǔn)溶液,在上述條件下反應(yīng)并測(cè)定吸光度,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0712x+0.0523(R2=0.9999)。

1.2.2 美拉德反應(yīng)模型析因試驗(yàn) 取5.0 mL牛肉湯提取物,按照表1,加入木糖和半胱氨酸,混合均勻,將pH調(diào)至7.0,110 ℃下加熱70 min,立即冰浴冷卻15 min以終止美拉德反應(yīng)。室溫條件下放置30 min后,進(jìn)行褐變程度的測(cè)定和感官評(píng)價(jià),每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 美拉德反應(yīng)模型析因試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of factorialexperiments of the Maillard reaction models

1.2.2.1 美拉德反應(yīng)模型褐變程度的測(cè)定 根據(jù)Yu[10]的方法,用去離子水將美拉德反應(yīng)液稀釋40倍,在420 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。

1.2.2.2 美拉德反應(yīng)模型的感官評(píng)定 選取10名(5男5女)感官評(píng)定人員,采取雙盲實(shí)驗(yàn)法對(duì)美拉德反應(yīng)液進(jìn)行十分制打分,評(píng)定過(guò)程中每位成員單獨(dú)進(jìn)行且互相零交流,每個(gè)樣品之間的評(píng)定間隔1 min,感官評(píng)定細(xì)則如表2所示。

表2 美拉德反應(yīng)模型感官評(píng)定表Table 2 Sensory evaluation of the Maillard reaction models

1.2.3 美拉德反應(yīng)模型中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定 按照曾茂茂等[11]的方法并稍作修改。取5 mL樣品置于20 mL頂空瓶中,加入10 μL 50 μg/mL的2-辛醇內(nèi)標(biāo)溶液,立即密封,將老化后的50 μm CAR/PDMS/DVB萃取頭插入樣品瓶頂空部分,于45 ℃吸附30 min,吸附后的萃取頭取出后插入氣相色譜進(jìn)樣口,于250 ℃解吸3 min,同時(shí)啟動(dòng)儀器采集數(shù)據(jù)。

色譜條件:揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在DB-WAX毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)中進(jìn)行分離;萃取頭在進(jìn)樣口進(jìn)行解吸附,進(jìn)樣口溫度250 ℃;以氦氣作為載氣,采用恒流模式,流速為0.8 mL/min;升溫程序:初始溫度40 ℃,保持3 min,然后以5 deg/min速度加熱至90 ℃,再以10 deg/min的速度升至230 ℃,保持7 min。

質(zhì)譜條件:電離模式EI+;發(fā)射電流100 μA;電子能量70 eV;檢測(cè)器電壓1000 V;接口溫度250 ℃;離子源溫度200 ℃;掃面模式為全掃描,質(zhì)量掃面范圍33～495 m/z。

1.2.4 美拉德反應(yīng)模型中雜環(huán)胺的測(cè)定 參考Zeng[12]的方法,并作適當(dāng)修改。取3 mL液體樣品加入30 mL 1 mol/L的NaOH溶液中,勻漿1 min;加入13 g硅藻土混合均勻;加入50 mL乙酸乙酯,超聲處理30 min;4 ℃下以12000×g的轉(zhuǎn)速離心10 min,取上清液,重復(fù)操作一次;將兩次的上清液混合,取10 mL上樣至預(yù)先用6 mL甲醇、6 mL水和6 mL鹽酸活化的Oasis MCX(3 cm3/60 mg)柱中;用6 mL 0.1 mol/L的鹽酸和6 mL甲醇淋洗;最后用6 mL甲醇和氨水的混合液(19∶1,v/v)進(jìn)行洗脫;將洗脫液通過(guò)0.22 μm微孔濾膜,待UPLC-MS分析。將雜環(huán)胺標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成0.2、0.5、1、2、5、10、20 ng/mL的混標(biāo)液,按下述條件進(jìn)行上機(jī)分析,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

色譜條件:Acquity UPLC BEH C18色譜柱(1.7 μm,2.1 mm×100 mm);柱溫35 ℃,采用二元流動(dòng)相梯度洗脫,流動(dòng)相A為10 mmol/L的醋酸銨(pH6.8),流動(dòng)相B為色譜純乙腈;流速設(shè)定為0.3 mL/min,進(jìn)樣量為1 μL。流動(dòng)相洗脫梯度為:0～0.1 min,10% B;0.1～18 min,10～30% B;18～20 min,30～100% B;20～20.1 min,100～10%B。

質(zhì)譜條件:離子源:電噴霧離子源;掃描方式:正離子掃描;毛細(xì)管柱電壓3.5 kV;離子源溫度120 ℃;脫溶劑溫度350 ℃;錐孔氣(氮?dú)?流速60 L/h;脫溶氣體(氮?dú)?流速650 L/h。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SAS 8.1數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析,數(shù)據(jù)顯著性差異使用鄧肯多重比較法(Duncan’s Multiple-rang test)進(jìn)行分析;數(shù)據(jù)作圖使用Origin Pro 9作圖軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛肉湯提取物中還原糖、氨基酸、多肽含量的變化

2.1.1 牛肉湯提取物中還原糖和多肽含量的變化 由圖1可知,95 ℃水浴加熱,隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng),牛肉湯提取物中還原糖的含量呈先上升后下降的趨勢(shì)。加熱30 min時(shí)還原糖的含量最高,為0.358 g/100 mL,加熱至50 min時(shí)還原糖的含量降低至0.308 g/100 mL,加熱至70 min時(shí)含量為0.208 g/100 mL,比0 min時(shí)下降了26.5%(P>0.05)。這可能是因?yàn)槌跏技訜徇^(guò)程中,牛肉湯中的蛋白質(zhì)和多肽加熱分解產(chǎn)生還原糖,使之含量上升[3];隨著還原糖含量的增加和加熱時(shí)間的延長(zhǎng),美拉德反應(yīng)占主導(dǎo),還原糖的含量隨之下降,50～70 min時(shí),反應(yīng)趨于平緩,還原糖含量變化不顯著(P>0.05)。

圖1 不同加熱時(shí)間下牛肉湯提取物中還原糖和多肽濃度Fig.1 Reducing sugar and peptide contentsin beef broth extracts at different heating times注:不同小寫字母表示相同指標(biāo)不同處理組之間差異顯著(P<0.05)。

95 ℃下加熱30 min時(shí),牛肉湯提取物中的多肽含量最高,為0.342 mg/mL,分別比0、50和70 min時(shí)高出66.0%、30.0%和40.2%(P<0.05),加熱50和70 min后多肽含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。這與Zhang[13]所得結(jié)論一致,可能是由于牛肉湯中蛋白質(zhì)在加熱過(guò)程中產(chǎn)生中間產(chǎn)物多肽,使牛肉湯提取物中的多肽含量先增加;同時(shí)多肽發(fā)生降解和美拉德反應(yīng),一方面降解成最終產(chǎn)物氨基酸,另一方面與牛肉湯中的還原糖反應(yīng),多肽的消耗速率大于生成速率,使之含量又明顯降低。牛肉湯提取物中既含有還原糖,又含有多肽等美拉德反應(yīng)前體物質(zhì),能夠賦予其理想的風(fēng)味。

2.1.2 牛肉湯提取物中氨基酸含量的變化 如表3所示,隨著加熱時(shí)間的增加,17種氨基酸總量呈先上升后下降的趨勢(shì),加熱30 min時(shí)氨基酸總量增加587.312 μg/mL(P<0.05)。隨著加熱時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng),總量又顯著降低(P<0.05),加熱50和70 min時(shí)氨基酸總量分別比30 min時(shí)降低2.66%和4.34%。與對(duì)照組相比,除天冬氨酸外,加熱30、50、70 min三個(gè)試驗(yàn)組中的氨基酸含量均顯著增加(P<0.05)。這可能是因?yàn)榧訜徇^(guò)程中,牛肉湯中的蛋白質(zhì)和多肽在蛋白水解酶、氨肽酶等酶的作用下水解產(chǎn)生氨基酸,同時(shí)氨基酸也參與了美拉德反應(yīng),消耗量多于生成量時(shí)導(dǎo)致了最終含量的下降[14]。

表3 不同加熱時(shí)間下牛肉湯提取物中氨基酸含量(μg/mL)Table 3 Amino acid content in peptide extracts at different heating times(μg/mL)

0 min時(shí)丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸、甘氨酸、絲氨酸和亮氨酸含量之和占氨基酸總量的55.89%,這是因?yàn)樵?0 ℃條件下加熱60 min的過(guò)程中,組織蛋白酶處于最適反應(yīng)溫度,水解釋放出部分游離氨基酸[15]。不同的加熱時(shí)間下,半胱氨酸和甲硫氨酸的含量均較少,加熱30、50、70 min后這兩種氨基酸的總量分別只增加了23.354、18.895、21.213 μg/mL,這與譚斌[16]的研究結(jié)果相似,說(shuō)明加熱過(guò)程中,蛋白質(zhì)和多肽水解產(chǎn)生較少的含硫氨基酸,而產(chǎn)生較多的丙氨酸、甘氨酸和谷氨酸等呈甜味和鮮味的氨基酸[17],它們是使牛肉湯呈現(xiàn)特殊風(fēng)味的重要氨基酸。值得注意的是,Jones等[18]的研究表明在美拉德反應(yīng)模型體系中脯氨酸和色氨酸共同作用可以加速對(duì)IQ類(MeIQx和7,8-DiMeIQx)雜環(huán)胺的抑制,也就是說(shuō),模型中不同氨基酸之間相互作用也會(huì)抑制雜環(huán)胺的形成。

由圖1和表3的結(jié)果可以看出,加熱30 min的試驗(yàn)組中還原糖、氨基酸和多肽的濃度均最高(還原糖含量0.195 g/100 g、總氨基酸含量1018.350 μg/mL、多肽含量0.342 mg/mL),所以本研究選取加熱30 min的牛肉湯提取物作為美拉德反應(yīng)的原液,不僅可以為美拉德反應(yīng)提供了重要的前體物質(zhì),直接影響還原糖-氨基酸(多肽)的美拉德反應(yīng)過(guò)程,從而影響其產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)[19-20],還可以影響雜環(huán)胺的形成。

2.2 底物濃度對(duì)美拉德反應(yīng)模型褐變程度、色澤和風(fēng)味的影響

2.2.1 底物濃度對(duì)美拉德反應(yīng)模型褐變程度和色澤的影響 美拉德反應(yīng)模型的褐變程度可以由吸光度值和色澤評(píng)分來(lái)表示。由表4可以看出,當(dāng)木糖和半胱氨酸添加量均為0.2 g時(shí),美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的色澤在6個(gè)試驗(yàn)組中的最受喜歡(P<0.01),呈現(xiàn)黃褐色、有光澤,與其相對(duì)應(yīng)的OD值大小適中。0.6 g木糖的所有處理組的色澤評(píng)分均比0.2 g木糖的3個(gè)處理組低,呈現(xiàn)深褐色、稍有光澤,OD值也都比0.2 g木糖處理組高。當(dāng)半胱氨酸添加量0.2 g,木糖0.6 g時(shí)體系的褐變程度最大,色澤最不受喜歡,呈現(xiàn)黑褐色、無(wú)光澤;與其相比,半胱氨酸增加至0.6和1.0 g時(shí),OD值分別降低了18.41%和13.76%(P<0.01),色澤表現(xiàn)為深褐色、稍有光澤。值得注意的是,木糖的方差貢獻(xiàn)(F=3240.614)是半胱氨酸的(F=145.710)22.24倍,即木糖對(duì)OD值的影響較半胱氨酸大。

表4 底物濃度對(duì)美拉德反應(yīng)模型OD值、色澤和風(fēng)味的影響Table 4 Effect of substrate concentrations on OD value,color and flavor of Maillard reaction models

由表5可以看出,木糖與半胱氨酸互作對(duì)美拉德反應(yīng)模型的褐變程度和色澤有顯著影響(P<0.05),木糖、半胱氨酸影響極顯著(P<0.01)。隨著木糖添加量由0.2 g增加至0.6 g,美拉德反應(yīng)模型的OD值增加97.79%,色澤評(píng)分降低24.36%。0.2 g半胱氨酸處理組的OD值分別比0.6和1.0 g半胱氨酸處理組高26.45%和16.50%(P<0.01);色澤與0.6 g處理組無(wú)極顯著差異,但都高于1.0 g處理組(P<0.01),分別高出11.76%和6.46%。MacDougall[21]指出不同濃度的木糖(1%、3%、5%)對(duì)木糖-甘氨酸/賴氨酸模型體系色澤作用效果不同;He等[22]研究表明分別在80、100、120和140 ℃下反應(yīng)2 h,未添加半胱氨酸的油菜籽肽-木糖模型其OD值高于添加1%半胱氨酸的處理組,色澤更深;這兩者與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。

表5 木糖、半胱氨酸及其交互作用的方差分析表Table 5 ANOVA for different contents of xylose,cysteine and their interaction

2.2.2 底物濃度對(duì)美拉德反應(yīng)模型風(fēng)味的影響 如表4所示,木糖和半胱氨酸添加量均0.2 g的美拉德反應(yīng)模型烤香味濃郁純正、焦糊味適中、幾乎沒(méi)有硫刺鼻味,在6個(gè)試驗(yàn)組中最受喜歡(P<0.01)。木糖添加量為0.2 g時(shí),模型的烤香味隨著半胱氨酸添加量的增加而越來(lái)越淡,焦糊味和硫刺鼻味則越來(lái)越濃。木糖添加量0.6 g,半胱氨酸0.2 g時(shí),模型體系的烤香味和硫刺鼻味較淡,焦糊味較濃。隨著半胱氨酸添加量的增加,烤香味、焦糊味和硫刺鼻味隨之變淡。半胱氨酸分別為0.6和1.0 g時(shí),木糖添加量由0.2 g增加至0.6 g,烤香味和焦糊味增加,硫刺鼻味降低。

木糖對(duì)硫刺鼻味具有極顯著影響(P<0.01),半胱氨酸對(duì)這3個(gè)感官指標(biāo)均具有極顯著性影響(P<0.01)。木糖和半胱氨酸互作對(duì)烤香味和硫刺鼻味具有極顯著影響(P<0.01)。因此,影響烤香味、焦糊味和硫刺鼻味得分的主效應(yīng)排序?yàn)?半胱氨酸>木糖。木糖處理組中,0.2 g添加量的烤香味、焦糊味和硫刺鼻味分別比0.6 g低5.38%、12.88%和20.98%。對(duì)于半胱氨酸,0.2 g處理組比0.6 g的烤香味、焦糊味和硫刺鼻味分別高33.14%、30.73%和51.05%(P<0.01),比1.0 g處理組分別高51.01%、58.71%和108.59%(P<0.01)。

半胱氨酸與羰基化合物結(jié)合參與高溫分解和strecker降解反應(yīng),產(chǎn)生多種雜環(huán)含硫化合物(如噻吩、噻唑),從而影響產(chǎn)物硫刺鼻味的形成,比如2-甲基-3-呋喃硫醇是熱加工牛肉中重要的具有烤肉香味的化合物[22]。另外,還產(chǎn)生了多種含氮、氧化合物,最典型的是具有明顯烤肉香氣的吡嗪類物質(zhì),賦予產(chǎn)物烤香味;而含氮化合物具有較低的閾值,使產(chǎn)物具有焦糊味[24-25]。而且,牛肉湯提取物中成分復(fù)雜,含有多種還原糖和氨基酸等,同樣引起模型體系的風(fēng)味變化,如半胱氨酸和賴氨酸對(duì)鮮味具有正效應(yīng),絲氨酸、亮氨酸和精氨酸則抑制鮮味的形成。這些原因共同作用,從而導(dǎo)致模型產(chǎn)物風(fēng)味的變化。這些結(jié)論與He等[22]的研究結(jié)果相同,油菜籽肽-木糖體系中,由于焦糖化反應(yīng),產(chǎn)生較多的含氧雜環(huán)化合物(如呋喃),閾值較高,產(chǎn)生較淡的焦糖風(fēng)味;而油菜籽肽-木糖-半胱氨酸體系產(chǎn)生的呋喃衍生物具有肉香味。

由底物濃度對(duì)美拉德反應(yīng)模型褐變程度、色澤和風(fēng)味的影響結(jié)果可以得出,木糖添加量為0.2 g、半胱氨酸添加量為0.2 g(即質(zhì)量濃度分別為0.04 g/mL)時(shí),獲得的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物色澤及風(fēng)味均最受喜歡,所以獲得的最優(yōu)組的美拉德反應(yīng)模型為:0.2 g木糖和0.2 g半胱氨酸添加至5 mL牛肉湯提取物中,中性條件下110 ℃反應(yīng)70 min。

2.3 美拉德反應(yīng)模型中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定結(jié)果

表6所示為反應(yīng)體系中色澤和風(fēng)味評(píng)分最高,即最優(yōu)組(木糖添加量為0.2 g,半胱氨酸添加量為0.2 g)的模型產(chǎn)物中揮發(fā)性風(fēng)味物種類和含量,檢測(cè)到烷烴、酮類、醛類、醇類、酯類、呋喃、噻吩、吡嗪、噻唑、酸類、酚類共11類、52種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),相對(duì)含量由大到小依次為:噻唑、酮類、吡嗪、呋喃、醛類、噻吩、醇類、酚類、酯類、酸類、烷烴類。噻唑、酮類、吡嗪和呋喃為主要的風(fēng)味物質(zhì),占總揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量的70%以上,吡嗪是烤香味的主要來(lái)源,呋喃能夠產(chǎn)生甜味和焦糖香味[24]。在52種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中,含量較高的有:4-甲基-5-羥乙基噻唑、二氫-2-甲基-3(2H)噻吩酮、3,3′-二硫代雙(2-甲基)-呋喃、2-甲基吡嗪和3-甲基丁醛等,相對(duì)質(zhì)量濃度分別為636.105、439.880、299.445、287.225、255.845 μg/L。

表6 美拉德反應(yīng)模型中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Table 6 Volatile flavor substances of the Maillard reaction models

本實(shí)驗(yàn)獲得的模型產(chǎn)物中烷基吡嗪,如2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪和2-乙基-3,5-二甲基吡嗪,相對(duì)質(zhì)量濃度分別為24.895、55.235、14.870、14.245、2.830 μg/L,馮濤[26]和García-Lomillo等[27]發(fā)現(xiàn)這幾種吡嗪類風(fēng)味化合物均具有烤香味;呋喃類物質(zhì)中2-甲基-3-巰基呋喃和3,3′-二硫代雙(2-甲基)呋喃的相對(duì)質(zhì)量濃度分別為6.715、299.445 μg/L,Specht等[22]和Bolton等[28]指出這兩種物質(zhì)可以賦予牛肉特殊的香氣;噻唑類物質(zhì),如2-乙?；邕虻南鄬?duì)質(zhì)量濃度為52.420 μg/L,可以產(chǎn)生烤牛肉香氣[29];產(chǎn)物中羰基化合物如3-甲基丁醛的相對(duì)質(zhì)量濃度為255.845 μg/L,壬醛和癸醛總相對(duì)質(zhì)量濃度為40.395 μg/L,譚斌[16]指出羰基化合物3-甲基丁醛可能對(duì)烤牛肉香氣非常重要,Van等[30]發(fā)現(xiàn)醛類物質(zhì)有利于熱加工牛肉風(fēng)味的形成。

2.4 美拉德反應(yīng)模型中雜環(huán)胺含量

12種雜環(huán)胺標(biāo)準(zhǔn)品(PhIP、IQ、MeIQx、8-MeIQx、7,8-DiMeIQx、4,8-DiMeIQx、AaC、MeAaC、Harman、Norharman、Trp-P-1、Trp-P-2)的色譜圖和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別如圖2、表7所示,線性范圍在0.2～110.3 ng/mL之間,相關(guān)系數(shù)在0.9933～0.9989之間,檢出限在0.013～0.205 ng/mL之間。

表7 UPLC-MS檢測(cè)12種雜環(huán)胺的分析特征Table 7 Analysis characteristics of 12 HCAs by UPLC-MS

圖2 12種雜環(huán)胺標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.2 UPLC chromatograms of 12 HCAs standard product注:縱坐標(biāo)代表百分比,具體指以峰面積最大Trp-P-1為100%,其他雜環(huán)胺所占的比例。

由圖3可以看出,木糖添加量為0.2 g,半胱氨酸添加量為0.2 g的美拉德反應(yīng)模型產(chǎn)物中共檢測(cè)出10種雜環(huán)胺,分別是PhIP、IQ、8-MeIQx、4,8-DiMeIQx、AaC、MeAaC、Harman、Norharman、Trp-P-1、Trp-P-2,總質(zhì)量濃度為2.660 ng/mL,主要雜環(huán)胺包括IQ、Norharman和PhIP,占總量的63.42%,其中IQ的含量顯著高于其余雜環(huán)胺(P<0.05),共產(chǎn)生1.027 ng/mL,而MeIQ和7,8-DiMeIQx兩種雜環(huán)胺未檢出。

圖3 美拉德反應(yīng)模型中雜環(huán)胺的質(zhì)量濃度Fig.3 Mass concentration of heterocyclicamines in Maillard reaction model注:不同小寫字母表示不同處理組之間差異顯著(P<0.05)。

Lee等[31]將2-甲基吡啶、肌酐和乙醛的水溶液在140 ℃下加熱1 h,采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定產(chǎn)生IQ 295 ng/g,而本研究模型產(chǎn)物中IQ的質(zhì)量濃度為0.935 ng/mL,降低了99.7%。Lee等[32]對(duì)甘氨酸-肌酐-葡萄糖模型體系進(jìn)行定性檢測(cè),發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物中含有MeIQ和7,8-DiMeIQx,而本試驗(yàn)獲得的模型產(chǎn)物中這兩種雜環(huán)胺未檢出。Shin等[33]研究結(jié)果表明,苯丙氨酸-肌酐-葡萄糖體系在180 ℃下反應(yīng)30 min,產(chǎn)生雜環(huán)胺總量為4761 ng/mL,遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)本研究模型中的雜環(huán)胺濃度。呂慧超等[5]采用固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定葡萄糖-肌酸酐-甘氨酸模型體系中的雜環(huán)胺含量,發(fā)現(xiàn)130 ℃下加熱1.5 h產(chǎn)生雜環(huán)胺總質(zhì)量濃度19.8 ng/mL,是本研究模型中雜環(huán)胺濃度的7.44倍。Linghu等[6]采用同樣的方法測(cè)出葡萄糖-肌酐-苯丙氨酸在180 ℃下加熱1 h產(chǎn)生PhIP共2446 ng/g,高出此模型中PhIP濃度(0.238 ng/mL)10276倍。與這些結(jié)果相比,分別將0.2 g木糖和半胱氨酸加入到5 mL牛肉湯提取物中,在pH7、110 ℃下反應(yīng)70 min,獲得的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中的雜環(huán)胺質(zhì)量濃度最低,表明本研究中的牛肉湯提取物-木糖-半胱氨酸體系可以抑制雜環(huán)胺含量的生成。

3 結(jié)論

以牛肉湯提取物為原液,通過(guò)析因試驗(yàn)研究不同添加量的木糖和半胱氨酸的美拉德反應(yīng)模型,得出pH7、反應(yīng)溫度110 ℃、時(shí)間70 min的條件下,木糖和半胱氨酸質(zhì)量濃度均為0.04 g/mL時(shí)的模型產(chǎn)物其OD值、色澤和風(fēng)味評(píng)分均最優(yōu)。檢測(cè)到此模型產(chǎn)物中含有噻唑、酮類、吡嗪和呋喃等共11類、52種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),其中3,3′-二硫代雙(2-甲基)呋喃、2-乙?；邕颉?,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪等風(fēng)味物質(zhì)具有烤牛肉香氣;共含有2.660 ng/mL的雜環(huán)胺,主要包括IQ、Norharman和PhIP,形成含量大幅減少。本試驗(yàn)獲得的美拉德反應(yīng)模型產(chǎn)物,進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了美拉德反應(yīng)的定向控制,降低雜環(huán)胺含量的同時(shí)產(chǎn)生理想風(fēng)味;為其在烤牛肉中的應(yīng)用及改善烤牛肉風(fēng)味、提高烤牛肉品質(zhì)提供一定的理論依據(jù)。