宋娟，姚麗娜，崔麗麗，王英平，鄭培和※

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130112；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130118）

植物染色體加倍研究有著較長(zhǎng)歷史，大量植物的染色體加倍獲得成功，而在藥用植物中染色體加倍研究相對(duì)較少，多為傘形科和百合科等，如當(dāng)歸、川貝母和黃芩等珍貴藥用植物[1]。藥用植物多倍體誘導(dǎo)最常用的技術(shù)為化學(xué)誘導(dǎo)，其中以秋水仙素試劑的效果最好。秋水仙素用于處理植物體細(xì)胞分裂狀態(tài)活躍的器官組織及生長(zhǎng)點(diǎn)[2]，如芽、花蕾、幼苗、萌動(dòng)的種子和愈傷組織等?，F(xiàn)代科學(xué)將化學(xué)誘變技術(shù)與植物組織培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，集合了組培技術(shù)可控培養(yǎng)條件和縮短植物生長(zhǎng)周期的優(yōu)勢(shì)，更有利于快速繁殖誘導(dǎo)成功的多倍體材料，以滿(mǎn)足育種和科研需求[3-4]。通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)，用秋水仙素處理培養(yǎng)材料，經(jīng)離體誘導(dǎo)培養(yǎng)后可獲得加倍的多倍體植株，如白菜型油菜與甘藍(lán)型雜交后F1 代種子經(jīng)秋水仙素處理，通過(guò)離體培養(yǎng)得到了混倍體植株[5]。

人參（Panax ginseng）是五加科人參屬重要藥材[6]，具大補(bǔ)元?dú)?、生津養(yǎng)血和補(bǔ)脾益肺等功效。本實(shí)驗(yàn)室已具備成熟的人參組培技術(shù)，現(xiàn)將秋水仙素處理后的人參種子，經(jīng)離體培養(yǎng)得到八倍體人參植株，其可用于育種研究工作。本研究通過(guò)透射電鏡觀察比較四倍體人參組培苗和八倍體人參組培苗的葉片顯微結(jié)構(gòu)，旨在為人參育種工作提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

材料為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所藥用植物資源與育種團(tuán)隊(duì)的人參組培苗，四倍體材料是由人參種子離體誘導(dǎo)分化得到的組培苗，八倍體材料是由四倍體種子經(jīng)秋水仙素處理后離體分化培養(yǎng)得到的組培苗，人參種子取自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所野生資源觀測(cè)站。誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基附加2 mg/L BA、4 mg/LGA、0.5 g/L 水解乳蛋白、30 g/L 蔗糖和5.5 g/L瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 倍性鑒定方法 選取繼代培養(yǎng)40 d 的四倍體和八倍體人參組培苗以及作為對(duì)照的大田人參葉片，剪取形態(tài)正常、生長(zhǎng)健壯且充分展開(kāi)的葉片0.5 cm2一塊置于6 mm 培養(yǎng)皿中，加入0.4 mL 細(xì)胞核提取緩沖液（Sysmex，05-5002），用刀片將樣品快速切碎，靜置1 min 后將得到的樣品懸浮液用500 目的過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾，再加入1.6 mL細(xì)胞核染色液（Sysmex，05-5002），暗處染色5 min 后，即可上機(jī)（Sysmex，PA）測(cè)倍性。采用Flowjo10 進(jìn)行倍性分析。

1.2.2 透射電鏡觀察法 選取繼代培養(yǎng)40 d 的四倍體和八倍體組培苗，切取葉片1 cm2若干，將材料放入2.5%固定液中，進(jìn)行抽氣處理，使材料盡快沉底，后室溫固定48 h。后用1%鋨酸固定液4 ℃固定24 h，梯度乙醇脫水，丙酮過(guò)渡，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，LKB-I 型超薄切片機(jī)切片，醋酸鈾和檸檬鉛雙重染色，觀察，拍照。并于菲利浦EM400T 透射電鏡下觀察葉片橫切結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

本研究選用未經(jīng)加倍處理的四倍人參組培苗和加倍后得到的人參組培苗（大田人參葉片作對(duì)照），3次重復(fù)測(cè)試，記錄細(xì)胞G1 期峰值。由流式細(xì)胞儀檢測(cè)的倍性結(jié)果如圖1：對(duì)照的G1 期穩(wěn)定峰值為100 道，四倍體的G1 期穩(wěn)定峰值為100 道，而加倍后的人參組培苗的G1 期穩(wěn)定峰值為200 道。加倍材料的G1 期峰值是四倍體的G1 期峰值的2 倍，可推測(cè)該加倍后的人參組培苗材料被加倍成八倍體。

圖1 人參組培苗四倍體、八倍體和對(duì)照人參葉片倍性檢測(cè)結(jié)果Fig.1 The leaf ploidy detections of tetraploid，octoploid in vitro and control ginseng in filed

2.2 四倍體和八倍體人參組培苗特征比較

由圖2、表1 可知，加倍后離體培養(yǎng)的人參組培苗與四倍體表型特征有著顯著差異：四倍體植株生長(zhǎng)旺盛，有與大田植株近似的掌狀葉，葉較狹長(zhǎng)；不同倍性人參組培苗在植株數(shù)、幼芽數(shù)和株高方面存在顯著差異，四倍體顯著大于八倍體，但在葉寬和葉長(zhǎng)方面，八倍體葉片顯著增大，葉片顏色加深[7-9]，存在部分葉片表現(xiàn)畸形。

圖2 不同倍性人參組培苗Fig.2 The tissue culture seedlings of different ploidy ginseng

表1 不同倍性人參組培苗性狀比較Table 1 The characters of the tissue culture seedlings of different ploidy ginseng

2.3 四倍體和八倍體人參組培苗葉片結(jié)構(gòu)比較

圖3 不同倍性人參組培苗葉片電鏡結(jié)構(gòu)Fig.3 The leaf electron microscopy structure of different ploidy ginseng in vitro

圖4 不同倍性人參組培苗葉肉組織結(jié)構(gòu)特征Fig.4 The characters of mesophyll tissues structure of different ploidy ginseng in vitro

圖5 不同倍性人參組培苗葉片表皮細(xì)胞厚度Fig.5 The epidermal cell thickness of different ploidy ginseng in vitro

2.3.1 四倍體和八倍體人參組培苗葉片組織結(jié)構(gòu)的比較 電鏡下觀察四倍體和八倍體人參組培苗葉片橫切面結(jié)構(gòu)（圖3A 和D），發(fā)現(xiàn)四倍體和八倍體人參組培苗葉片上下表皮細(xì)胞均為單層，但四倍體葉片多為5層細(xì)胞構(gòu)成，而八倍體葉片多為7 層；四倍體和八倍體人參組培苗葉片厚度都不均勻，且四倍體和八倍體組培苗葉片的柵欄薄壁組織和海綿薄壁組織均分化不明顯[10]，八倍體的細(xì)胞增大，細(xì)胞大小差異增大；八倍體葉片厚度、柵欄薄壁組織和海綿薄壁組織總厚度分別較四倍體增加了約39.30% 和51.02%（圖4），八倍體柵欄薄壁組織和海綿薄壁組織的細(xì)胞層數(shù)增加，但細(xì)胞大小差異較大；八倍體人參組培苗葉片的表皮細(xì)胞相較于四倍體增厚，上下表皮厚度分別增加了38.53%和23.65%（圖5）。

2.3.2 四倍體和八倍體人參組培苗葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的比較 透射電鏡下觀察四倍體和八倍體人參組培苗葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)，葉肉細(xì)胞內(nèi)均含豐富的細(xì)胞器（圖3B、3C、3E、3F）。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在四倍體和八倍體人參組培苗的細(xì)胞中均含有大量葉綠體，且其內(nèi)可見(jiàn)由基粒片層組成的基粒和數(shù)量、大小不等的淀粉粒、嗜鋨顆粒。八倍體人參組培苗葉肉細(xì)胞中葉綠體數(shù)量多，且體積小于四倍體，其內(nèi)富含的淀粉粒數(shù)量多于四倍體。四倍體人參組培苗葉肉細(xì)胞中葉綠體內(nèi)含有大量清晰的基粒且形狀規(guī)則，基粒片層垛疊緊密且垛疊厚度較大；而八倍體人參組培苗葉綠體內(nèi)基粒片層垛疊較少，其光合產(chǎn)物運(yùn)輸效率較低，光合產(chǎn)物積累過(guò)剩會(huì)抑制光合速率[11]。因此，加倍得到的八倍體人參組培苗葉綠體結(jié)構(gòu)的光合特性相對(duì)于四倍體較弱，這與其組培苗形態(tài)特征表現(xiàn)一致。

3 討論

離體誘導(dǎo)法[12]即組織培養(yǎng)誘變法，是對(duì)植物某一離體部位進(jìn)行秋水仙素處理，再進(jìn)行組織培養(yǎng)，或在組織培養(yǎng)過(guò)程中進(jìn)行染色體加倍處理的方法。該方法已經(jīng)應(yīng)用在很多藥用植物中獲得同源多倍體，如黃芩、決明和丹參等材料的愈傷組織。陳素萍等[13]通過(guò)在培養(yǎng)基中加入秋水仙素直接誘導(dǎo)種子加倍，再通過(guò)胚軸組織培養(yǎng)的方法獲得四倍體植株。本研究也是通過(guò)秋水仙素處理人參種子，再通過(guò)組織培養(yǎng)的方法獲得八倍體組培苗。

多倍體植物具有一種特殊的形態(tài)特性，與正常倍性植株相比，根、莖、葉、花和種子等器官表現(xiàn)出巨型性[14]。加倍后離體培養(yǎng)的人參組培苗的特征表型與其他植物，如矮牽牛、郁金香、黃瓜和板藍(lán)根等[15]多倍體的表現(xiàn)基本一致，葉片厚度增加、葉片增大、顏色加深等，但植株數(shù)量減少，部分葉片畸形。在腋花杜鵑組培苗的倍性誘導(dǎo)中發(fā)現(xiàn)有葉片肥厚、葉片畸形扭曲和莖段明顯變粗3 種形態(tài)變異的過(guò)半為多倍體[16]；四倍體小黧的柄增長(zhǎng)，開(kāi)花時(shí)間較二倍體延長(zhǎng)[17]?？梢?jiàn)，在多倍體育種研究中，加倍后的植株與原正常植株相比存在很多不同，多表現(xiàn)在根、莖、葉、花和果實(shí)等表型特征上。

葉片作為植物進(jìn)行光合作用的主要器官，其形態(tài)結(jié)構(gòu)直接影響著植物的光合作用，本研究中，初步對(duì)四倍體和八倍體人參組培苗葉片解剖和顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。從葉片組織結(jié)構(gòu)來(lái)看，八倍體人參組培苗葉片較四倍體厚39.30%；柵欄組織和海綿組織細(xì)胞層數(shù)增加，細(xì)胞增大且差異增加；八倍體上下表皮細(xì)胞厚度較四倍體也明顯增加，這都是多倍化效應(yīng)導(dǎo)致的[18-20]。在對(duì)四倍體和八倍體人參組培苗葉片葉肉細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)的初步研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞器中以葉綠體的差異較明顯：八倍體人參組培苗葉片的葉綠體內(nèi)的基粒數(shù)量和基粒片層垛疊數(shù)量都遠(yuǎn)小于四倍體。張虹等[21]發(fā)現(xiàn)，可能是較高的染色體拷貝數(shù)致使細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能異常、生命代謝活動(dòng)受阻，從而影響了黑果枸杞八倍體葉片的葉綠素含量，使其顯著低于二倍體和四倍體。本研究?jī)H對(duì)四倍體和八倍體人參組培苗葉片的葉綠體進(jìn)行了初步分析，針對(duì)倍性變化對(duì)人參組培苗內(nèi)葉綠體的影響還需進(jìn)一步研究。