趙駿達 郭春鳳 武 欣

（1新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院婦科中心 烏魯木齊 830011；2復旦大學附屬婦產科醫(yī)院婦科 上海 200011）

據最新數據統(tǒng)計顯示，全球范圍內宮頸癌在女性所有類型腫瘤中發(fā)生率和致死率均排在第四位，而在女性生殖系統(tǒng)腫瘤中發(fā)生率和致死率均為第一［1］。在我國，宮頸癌在女性所有類型腫瘤中發(fā)生率為第七位而致死率居第八位，在女性生殖系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率和致死率也均為第一位［2］。隨著經濟水平的提高，宮頸癌在治療方案上也已有了長足的進步（如手術方式、放化療等），而分子靶向治療也已展現出了充滿希望的前景，但由于癌癥異質性的特點導致這些治療方案的效果很難再進一步提高［3-4］。目前中國對于術后宮頸癌的分期主要采用國際婦產科聯(lián)盟制定的FIGO 分期系統(tǒng)，是現有比較簡潔并且能對宮頸癌患者的預后和臨床治療做出較為準確指導的一套分期系統(tǒng)。然而，由于宮頸癌異質性的原因，現有證據顯示處于同一分期的不同宮頸癌患者之間生存期預后存在很大差異［5］。因此，通過研究將宮頸癌患者的分子信息與現行FIGO 分期系統(tǒng)結合起來或許能提高對宮頸癌患者預后判斷的準確性，并改進目前針對宮頸癌的臨床治療方案。

Ras-GTP 酶激活蛋白SH3 結構域結合蛋白1（Ras-GTPase-activating protein SH3 domain bindingprotein1，G3BP1）是 G3BP 家族的成員之一，由于G3BP1 可與RasGAP 的SH3 結構域相結合而于 1996 年被發(fā)現［6］。G3BP1 中含有一個高度保守的氨基端核轉運子2（N-terminal nuclear transport factor 2）樣結構域，此結構域與G3BP1 的二聚化、應激顆粒的組裝以及G3BP1 與其他促增殖相關蛋白的結合有關［7-8］。此外，G3BP1 在其羧基端含有一個RNA 識別模體，該模體能特異識別結合mRNA 序列，并通過其依賴磷酸化而活化的RNA 酶活性降解這些 mRNA，包 括 c-MYC、PMP22、ATP5B 和BART 等［9］。已有文獻提示，G3BP1 在抗病毒感染和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要調控作用［10-12］。研究證實，G3BP1 在乳腺癌、結腸癌、頭頸部癌、胃癌、胰腺癌和食管癌等惡性腫瘤組織中的表達顯著升高，可促進乳腺癌細胞的增殖，增強胰腺癌和肝癌細胞的侵襲能力并促進纖維母細胞進入S 期等［13-17］。在肺癌、結腸癌和食管癌等細胞系中，下調G3BP1 被發(fā)現可抑制癌細胞的生長遷移、侵襲并誘導癌細胞凋亡［18-20］。然而，關于 G3BP1 在宮頸癌中的表達和臨床意義尚無報道。本文擬通過對我院收治的306例宮頸癌患者進行回顧性分析，探討G3BP1 在宮頸癌中的表達及其與腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關性。

材料和方法

組織樣本收集復旦大學附屬婦產科醫(yī)院2012 年1 月至2013 年8 月的宮頸癌手術標本306例，患者術前均未接受過化療或放療。組織標本均為復旦大學附屬婦產科醫(yī)院病理科提供的石蠟標本，且均由病理科醫(yī)師做出診斷。所收集的臨床病例信息包括：年齡、病理類型、腫瘤大小、局部浸潤（肌層浸潤、宮旁浸潤、陰道浸潤）、盆腔淋巴結轉移和FIGO 分期等。對于患者進行隨訪的時間為術后1、3、6、12 個月，1 年后每 6～8 個月隨訪 1 次，通過電話、門診進行隨訪。對照正常宮頸組織以及上皮內瘤變組織也由復旦大學附屬婦產科醫(yī)院病理科提供。該研究已獲得復旦大學附屬婦產科醫(yī)院倫理委員會批準，本研究中獲取實驗標本的患者均在術前簽署知情同意書，同意將個人的臨床、病理資料和手術標本用于科學研究。

組織芯片制備調取宮頸癌組織石蠟組織塊對應的HE 染色切片，由病理科醫(yī)師與婦科醫(yī)師共同鏡檢標定切片中的典型區(qū)域，并在石蠟組織塊上標記對應的預計打孔區(qū)域。之后用組織芯片制作器在空白蠟塊上打直徑1 mm 的孔，制作受體蠟塊，并在供體蠟塊預先標記的區(qū)域內打孔采集1 mm 左右的組織芯。將組織芯放入受體蠟塊中形成芯片蠟塊，嚴密固定。置于55 ℃恒溫箱中10 min。在石蠟即將完全融化時取出芯片蠟塊，置于室溫下冷卻，使組織芯與受體蠟塊融合。之后進行4 μm 連續(xù)切片，將切片轉移至載玻片上，60 ℃烤片，最后置于4 ℃冰箱保存。

免疫組織化學染色將組織芯片置于二甲苯中脫蠟，并經無水乙醇、95%、80%和70%乙醇梯度水化。TBST 沖洗后，組織芯片放入0.01 mol/L 檸檬酸緩沖液中煮沸，進行抗原修復。之后甩干，滴加適量封閉液防止非特異性染色。G3BP1 一抗（美國Proteintech 公司，13057-2-AP，濃度 1∶100）37 ℃孵育3 h，TBST 緩沖液沖洗后滴加適量一抗增敏劑。再滴加適量辣根過氧化物酶標二抗聚合物，室溫孵育10 min。最后DAB 顯色液孵育，蘇木精襯染，脫水，封片。利用自動掃描顯微鏡和圖像分析系統(tǒng)拍攝免疫組化染色照片。讀片由病理科醫(yī)師獨立完成，讀片前后均不告知患者的任何信息，讀片標準為：（1）目的蛋白染色陽性定義為≥5%腫瘤細胞的胞質內可見棕褐色染色；（2）染色強度評分計0～3 分，0 分為陰性，1 分為弱陽性，2 分為中度陽性，3 分為強陽性；（3）染色范圍評分計 0～4 分，0 分為＜5%，1分為 5%～24%，2 分為 25%～49%，3 分為 50%～74%，4 分為75%～100%。最后CES 評分為染色強度評分×染色范圍評分。

利用3 個宮頸癌數據集分析宮頸癌和癌旁組織中G3BP1 的mRNA 水平包含宮頸癌和癌旁信息的 GSE6791、GSE7803 和 GSE7410 數據集從 GEO數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi）下載，并提取G3BP1 mRNA 相對表達水平進行分析。

統(tǒng)計學分析通過雙尾t檢驗統(tǒng)計分析兩組數據間的差異，通過One-Way ANOVA 統(tǒng)計分析多組數據間的差異。根據免疫組化CES 評分結果和ROC 曲線將宮頸癌患者分為G3BP1 低表達組和G3BP1 高表達組。用χ2檢驗比較G3BP1 表達水平與臨床病理資料的關系。Kaplan-Meier 法繪制G3BP1 低表達和高表達患者的生存曲線，Log-rank檢驗比較G3BP1 低表達和高表達患者的生存差異。用單因素Cox 回歸分析臨床病理特征及G3BP1 表達情況對患者預后的影響，將單因素Cox 回歸分析中的危險因素納入多因素Cox 回歸分析，分析患者的獨立預后因素。ROC 曲線比較TNM 分期與TNM 分期+G3BP1 表達對患者生存情況的預測效果。t檢驗、One-Way ANOVA、χ2檢驗、Log-rank 檢驗、Cox 回歸分析由SPSS19.0 軟件完成，計算C-index 由 R 3.1.2 軟 件 完 成 。

結 果

G3BP1 在宮頸癌組織中的表達情況為了檢測宮頸癌組織中G3BP1 的表達水平是否發(fā)生變化，我們首先分析了包含癌和癌旁信息的宮頸癌GSE6791、GSE7803 和 GSE7410 數據集，結果顯示G3BP1 的mRNA 水平均有上調（圖1A）。我們利用包含正常、低/高級別鱗狀上皮內病變和宮頸癌的組織芯片，檢測G3BP1 的蛋白表達水平。發(fā)現G3BP1的蛋白表達水平從低級別鱗狀上皮內病變開始增高，并且隨著疾病進程有遞增的趨勢（圖1B、1C）。這些結果顯示G3BP1 在宮頸癌中表達上調。

G3BP1 表達水平與宮頸癌患者臨床病例資料的相關性分析根據免疫組化的CES 評分結果，利用ROC 曲線發(fā)現CES 為6 時具有最大的曲線下面積（圖2A）。因此，我們以CES 6 作為截斷值，將306例宮頸癌患者樣本分為G3BP1 高表達組與G3BP1低表達組。利用χ2檢驗分析宮頸癌組織中G3BP1的表達水平與患者臨床病理資料的相關性（表1）。結果顯示，G3BP1 的高表達與年齡（P=0.023）、腫瘤大?。≒＜0.001）、腫瘤分化（P=0.007）、肌層浸潤（P=0.001）、陰道浸潤（P＜0.001）、盆腔淋巴結轉移（P=0.009）以及FIGO 分期（P＜0.001）相關，而與病理分型和宮旁浸潤無顯著相關性（表2）。

G3BP1 高表達與宮頸癌患者總體生存率的相關性分析利用Kaplan-Meier Plotter 在線生存預測網 站（http：//kmplot.com/analysis/index.php？p=service & cancer=pancancer_rnaseq）分析 G3BP1 的基因表達水平與宮頸癌患者總體生存的關系，并發(fā)現G3BP1 基因的高表達與患者不良預后相關（圖2B）。同時我們利用306 位宮頸癌患者的跟蹤隨訪資料，研究G3BP1 的蛋白表達水平與宮頸癌患者總體生存率的關系。通過Kaplan-Meier 分析發(fā)現G3BP1 高表達患者的總體生存率顯著低于低表達組（圖2C）。為了進一步驗證G3BP1 的表達水平對不同宮頸癌FIGO 分期患者生存的預測效果，我們根據FIGO 分期將306 名宮頸癌患者分成早期組和進展期組兩個亞分期組。由于宮頸癌Ⅲ～Ⅳ期的患者往往已經不能直接進行手術治療，無法獲得組織樣本，因此306 位宮頸癌患者的分期僅包含Ⅰa～Ⅱb。我們將 FIGO Ⅰa～Ⅰb 為早期組，FIGO Ⅱa～Ⅱb 為進展期組。通過生存分析發(fā)現，在這兩個亞分期組中，G3BP1 的表達水平都可以對宮頸癌患者的總生存率結果進行預測（圖2D、2E）。這些結果表明，G3BP1 在宮頸癌組織中的高表達可能提示宮頸癌患者的不良預后生存。

圖1 G3BP1 在宮頸癌組織中的表達情況Fig 1 Expression of G3BP1 in cervical cancer tissues

G3BP1 表達水平與宮頸癌患者總體生存情況的關系為了探討各種臨床病理因素以及G3BP1表達水平在判斷宮頸癌患者總體生存情況中的作用，我們利用單因素Cox 回歸進行分析，發(fā)現陰道浸潤（P=0.011）、FIGO 分期（P=0.003）以及 G3BP1 表達水平（P＜0.001）與宮頸癌患者的預后相關（表3）。將以上與宮頸癌患者生存情況相關的臨床病理因素以及G3BP1 表達水平進行多因素Cox 回歸分析，發(fā)現FIGO 分期以及G3BP1 的表達水平可以作為判斷該批宮頸癌患者總體生存情況的獨立預后因素（表3）。

G3BP1 表達水平聯(lián)合FIGO 分期預測宮頸癌患者的生存情況上述結果表明，G3BP1 的表達水平可作為宮頸癌患者的獨立預后因素。為探究G3BP1 的表達水平是否能夠提高傳統(tǒng)FIGO 分期的預后效率，我們對FIGO 分期、G3BP1 的表達水平、以及FIGO 分期聯(lián)合G3BP1 表達水平制作了ROC曲線進行分析。結果表明，單獨G3BP1 表達水平（AUC=0.738，95%CI：0.616～0.860）比單獨 FIGO分期（AUC=0.659，95%CI：0.537～0.782）的預后性更好。聯(lián)合FIGO 分期和G3BP1 表達水平（AUC=0.800，95%CI：0.696～0.904）增加了單獨 FIGO 分期對宮頸癌患者預后的預測準確性（圖3A）。

此外，聯(lián)合FIGO 分期和G3BP1 表達水平的一致性指數（Harrell's concordance index，C-index）為0.659，比單獨 FIGO 分期的一致性指數（0.589）高（圖3B）。同時，單獨FIGO 分期預測模型的赤池信息量（akaike information criterion，AIC）為 554.643；當聯(lián)合G3BP1 的表達水平之后，模型的AIC 會降低到539.083（圖3B）。綜上，將G3BP1 的表達水平聯(lián)合傳統(tǒng)的FIGO 分期能建立更優(yōu)的預后模型，更準確地預測宮頸癌患者的生存情況。

表2 306 例宮頸癌患者中G3BP1 表達水平與臨床病理資料的相關性分析Tab 2 Correlation between G3BP1 expression and clinicopathological variables of 306 cervical cancer patients

討 論

雖然隨著HPV 疫苗的不斷普及，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率有望得到有效控制，但目前宮頸癌死亡率和發(fā)病率依然在全世界范圍和我國女性生殖系統(tǒng)腫瘤中排第一位。多數情況下，早期宮頸癌并無癥狀或僅有非特異癥狀而不能及時引起注意，所以宮頸癌在發(fā)現時往往已處于進展期，從而失去最佳的治療時機。盡管近幾十年來對宮頸癌的治療有了顯著進步，但是宮頸癌患者，尤其是發(fā)生淋巴結轉移患者的生存預后仍不能令人滿意。宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展是由諸多外界和內部因素的改變引起的，而目前預測宮頸癌患者生存預后的體系主要是FIGO 分期系統(tǒng)，其未考慮宮頸癌的異質性，因此在對宮頸癌患者進行生存預后以及制定治療方案時存在一定缺陷。因此，探索宮頸癌中新的分子標志物對理解腫瘤進展的機制以及改善和制定治療方案具有重要意義。本研究中，我們發(fā)現G3BP1 在宮頸癌中表達上調，G3BP1 高表達可能是宮頸癌患者的獨立危險預后因素，因此將G3BP1 作為預后因素對宮頸癌患者的預后進行綜合考慮有望提高預測的準確性，從而使治療方案的制定更為合理。

表1 306 例宮頸癌患者的臨床病理資料Tab 1 Clinicopathological variables of 306 cervical cancer patients

圖2 G3BP1 的高表達提示宮頸癌患者總體生存的不良預后Fig 2 High G3BP1 expression predicts poor prognosis of cervical cancer patients

表3 臨床病理因素與宮頸癌患者整體預后的單因素和多因素Cox 回歸分析Tab 3 Univariate and multivariate Cox regression analysis of clinicopathological characteristics influencing the overall survival of cervical cancer patients

圖3 G3BP1 表達聯(lián)合FIGO 分期判斷宮頸癌患者預后Fig 3 Combination of G3BP1 expression with FIGO stage predict the overall survival of cervical cancer patients

G3BP1 首次被發(fā)現是由于它能與RasGAP 結合而成為Ras 信號通路的下游分子［6］，但最近也有研究結果質疑G3BP1 與RasGAP 之間的結合。已有多篇文獻提示G3BP1 可以通過發(fā)揮信號調節(jié)分子的作用，從而影響腫瘤細胞的增殖、生存和轉移。例如，G3BP1 下調可以通過抑制Ras 和下游激酶MEK/ERK 活性來抑制結腸癌HCT116 細胞的生長等［21］。而在乳腺癌細胞中G3BP1 的高表達增強了 由 TGF-β1 誘 導 的 Smad2/3 活 化 ，而 在 被 敲 低G3BP1 的細胞中，Smad2/3 磷酸化低于正常表達水平的細胞［22］。進一步的研究表明，包含 G3BP1 和Smad2/3/4 的復合物激活Smad 靶基因的轉錄和表達，以促進乳腺癌細胞的上皮間質轉化和遷移/侵襲［22］。在肺癌 H1299 細胞中，G3BP1 下調顯著抑制細胞Src、FAK 和ERK 的磷酸化，從而抑制了腫瘤細胞的遷移和侵襲能力［19］。在腎癌中，G3BP1 則可以通過上調IL-6 表達來活化STAT3 通路，從而促進腫瘤的進展和腫瘤細胞的上皮間質轉化和轉移［23］。此外，G3BP1 也能夠抑制抑癌基因 p53 的活性。G3BP1 能結合p53 C-端的核定位和輸出序列，這種結合可以阻斷p53 的核定位，導致p53 異常保留在細胞質中，從而抑制凋亡［24］。最近的研究表明，細胞溶質中長鏈非編碼RNA p53RRA 與G3BP1 相互作用，p53RRA-G3BP1 相互作用將 p53從G3BP1 復合物中置換出來，促使p53 保留在細胞核中，從而啟動細胞周期停滯、凋亡等［25］。

mRNA 穩(wěn)定性在基因轉錄后調控以及腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。影響mRNA 穩(wěn)定性的因素很多，如 5’-末端加帽、3’-末端多聚 A 尾、3’-非翻譯區(qū)和3’-非翻譯區(qū)等。已有文獻報道，G3BP1 能夠通過其C 端的RRM 結合特定的RNA，并在胞嘧啶和腺嘌呤殘基之間剪切RNA 以調節(jié)mRNA 的穩(wěn)定性，從而影響多種信號傳導途徑［26］。研究表明，G3BP1 既可以促進mRNA 的穩(wěn)定性，如tau mRNA 等，也可以誘導mRNA 的降解，包括BART、CTNNB1、ATP5B、PMP22 和 GAS5 等 。其中，PMP22 是一種生長阻滯特異性基因，抑制PMP22 的表達可促進乳腺癌細胞增殖［27］。而CTNNB1 則是一種重要的癌基因，文獻發(fā)現G3BP1可與 CTNNB1 的 mRNA 直接結合［28］。wnt3a 可以促進G3BP1 發(fā)生精氨酸甲基化，而甲基化的G3BP1可以促進CTNNB1 的mRNA 降解，從而負調節(jié)Wnt/β-catenin 通路［28］。

此外，G3BP1 也被報道是應激顆粒的組分，并且對于應激顆粒的組裝和形成是必需的［8］。應激顆粒是真核細胞暴露在外界環(huán)境刺激下（熱休克、病毒感染、氧化應激、紫外線輻射、缺氧等），翻譯起始受損時或者受到抑制時在胞質內暫時形成的一種高密度結構［29］。應激顆粒最早在細胞處于高溫環(huán)境下被發(fā)現，并特征性地包含多種小分子量的熱休克蛋白。之后研究發(fā)現mRNA 和很多核糖體蛋白質都是應激顆粒的組成成分。傳統(tǒng)的觀念認為，應激顆粒的形成與蛋白質翻譯的阻滯有關，在神經軸突細胞中G3BP1 也可以通過抑制mRNA 的翻譯阻止神經再生［30］。但近期研究發(fā)現，應激顆粒的形成有助于促進mRNA 在細胞局部的聚集并增強某些特定的與細胞生存相關的mRNA 的翻譯，因此在腫瘤細胞的生存和耐藥過程中發(fā)揮重要調節(jié)作用［31］。我們的研究發(fā)現G3BP1 在宮頸癌組織中表達上調，提示G3BP1 的高表達有助于促進體內應激顆粒的形成以及腫瘤細胞對外界刺激的抵抗，從而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

盡管在我們的研究中已經提出了G3BP1 表達水平在宮頸癌中的臨床意義，但在已知的單變量分析中，腫瘤分化、局部浸潤和盆腔淋巴結轉移等預后因素不顯著。因此，這項研究還存在一些局限性，包括：（1）納入本研究的患者人數依然有限，同時受到手術的限制，中晚期患者的比例較低；（2）本研究所納入的樣本僅從一家單位收集。因此，在后期的工作當中，需要大量、多中心、前瞻性的樣本和數據來驗證這些結果。此外，G3BP1 除了可以作為判斷預后的標志物外，也有可能可以成為腫瘤治療的靶點。已有研究人員基于RasGAP 與G3BP1 的相互作用設計合成抗腫瘤肽38GAP 和GAP161，發(fā)現這兩種新的多肽不僅增強了小劑量順鉑等傳統(tǒng)抗癌藥物的抗腫瘤活性，而且對腫瘤細胞有直接的抑制作用［21，32］。綜上，我們的研究發(fā)現 G3BP1 高表達可能是宮頸癌患者的獨立危險預后因素，并可能參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展等進程。G3BP1 不僅可以作為判斷宮頸癌患者預后的標志分子，還有望作為新的靶點為宮頸癌的臨床治療提供更多的可能方案。