程平言，路 虎，胡 峰，涂華彬

（貴州茅臺酒廠（集團）習(xí)酒有限責(zé)任公司，貴州習(xí)水 564622）

實時熒光定量PCR 技術(shù)于1996 年由美國Applied Biosystems 公司開發(fā)，相對于傳統(tǒng)PCR 技術(shù)，該技術(shù)實現(xiàn)了PCR 從定性到定量的質(zhì)的飛躍，而且比傳統(tǒng)PCR 技術(shù)具有更強的特異性，靈敏度高等優(yōu)點，更由于其在定量方面的準(zhǔn)確性和自動化程度高等特點，已在分子生物學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[1]。但是，目前為止，實時熒光定量PCR 技術(shù)在白酒釀造過程中微生物檢測方面的研究較少，而采用傳統(tǒng)微生物計數(shù)的方法并不能真實有效的反映發(fā)酵體系中微生物的種類和數(shù)量。如若采用實時熒光定量PCR 的方法，則可以實時、快速、簡便的對發(fā)酵體系中的微生物進行跟蹤檢測。

1 實時熒光定量PCR 的原理

實時熒光定量PCR 技術(shù)，是指在PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號的累積實時監(jiān)測PCR 進程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法[2]。在熒光定量PCR 中，有一個很重要的參數(shù)：Ct 值。C 是Cycle 的縮寫，t 是threshold 的縮寫，Ct值的意義是反映管內(nèi)的熒光信號達到所設(shè)定閾值時經(jīng)過的循環(huán)數(shù)。經(jīng)研究[3]表明，每個模板的Ct 值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)呈現(xiàn)線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越大，Ct 值越小。如此便可以通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品建立熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。這樣檢測到未知濃度的基因組的Ct值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以推算該基因組的起始濃度。

2 熒光檢測方法

目前最常用于熒光信號檢測的一般可分為3種類型：

一是熒光染料的方法，目前熒光染料應(yīng)用最廣泛的是SYBR GreenⅠ，在實時熒光定量PCR 反應(yīng)體系中，添加過量的SYBR GreenⅠ染料，它能特異性的結(jié)合到DNA 雙鏈的小溝上從而產(chǎn)生熒光信號[4]，沒有結(jié)合雙鏈的SYBR GreenⅠ 是不產(chǎn)生熒光信號的。添加熒光染料進行熒光檢測的方法最大的特點是簡單易操作，但是由于SYBR GreenⅠ 能結(jié)合到所有DNA 的雙鏈上，如果PCR 反應(yīng)體系中出現(xiàn)非特異性擴增，此方法的定量準(zhǔn)確性就會降低。不過，我們可以通過實時熒光定量PCR 的一些分析軟件查看最后PCR 產(chǎn)物的溶解曲線來進行分析。

二是雙標(biāo)記探針法，此方法的原理是通過標(biāo)記熒光染料的基因特異寡核苷酸探針來檢測產(chǎn)物。目前在此方法體系中應(yīng)用最廣泛的為TaqMan探針。TaqMan 探針也是一寡核苷酸，其5'端標(biāo)記一個報告熒光基團，3'端標(biāo)記一個淬滅基團。當(dāng)此探針不結(jié)合到DNA 上時，檢測不到5'端熒光基團所發(fā)出的熒光[5]。但是當(dāng)PCR 褪火時，引物與探針開始與模板結(jié)合，此時5'端熒光基團將會脫離出來進入到反應(yīng)體系中，由于不再受到3'端淬滅基團的干擾，從而可以產(chǎn)生熒光信號，進而能被儀器檢測到。此方法中，每結(jié)合一個模板就會有一個熒光信號產(chǎn)生，就能實現(xiàn)PCR 過程的實時檢測。

三是分子信標(biāo)法，分子信標(biāo)指的是一種形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的探針，呈現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)時，報告熒光基團產(chǎn)生的熒光信號被淬滅基團屏蔽，當(dāng)探針與模板結(jié)合時，發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，呈現(xiàn)一種線性結(jié)構(gòu)，進而報告熒光基團與淬滅基團的物理距離增加，熒光信號不再屏蔽[6-7]，進而可以被檢測到。

雙標(biāo)記探針法和分子信標(biāo)法原理[8]如圖1所示。

3 待擴增序列的選擇

PCR 的擴增序列一般從兩方面來考慮：一方面是從16S rDNA[9]，一方面是從功能基因[10]。16S rDNA 上一般含有穩(wěn)定的保守序列，其含量的多少可以用來表征某一類微生物的基因組含量。目前擴增16S rDNA 應(yīng)用比較廣泛，在土壤微生物、食品微生物、醫(yī)學(xué)等方面都得到極大的應(yīng)用[11-12]。功能基因是指某一類微生物具有相同的化合物的合成生理特性，而具有相同的功能基因序列[13]，所以也可以對其功能基因進行定量來表征某一類微生物的基因組含量。

4 基因組提取方法

根據(jù)是否在提取基因組前將微生物從環(huán)境中分離出來，可分為原位破碎和異位破碎[14-15]。原位破碎是指直接對環(huán)境中的微生物進行細胞破碎，進而進行分離純化。異位破碎是指先將微生物從環(huán)境中分離出來，再進行細胞破碎，進而提取微生物基因組。

無論是原位破碎還是異位破碎，目的都是要將環(huán)境微生物細胞壁破碎，進而對基因組進行分離和純化。破壁方法[16-18]目前應(yīng)用較多的就是溶菌酶破碎、玻璃珠破碎、液氮研磨破碎等。

一般原位破碎法比異位破碎法提取到的基因組濃度要高。作者曾經(jīng)對大曲中微生物基因組提取方法進行研究，結(jié)果如2 圖所示。

從圖2 可以明顯看出，異位破碎方法提取到的基因組濃度明顯要低于原位破碎法。雖然異位破碎法得到的基因組濃度較低，但是所得基因組純度卻是最高的。對所得基因組進一步進行熒光定量PCR 實驗，分析擴增效率，若是基因組純度對擴增效率影響不大，則可以選擇原位破碎法進行大曲微生物基因組提取。

5 實時熒光定量PCR 在白酒釀造過程中的應(yīng)用前景

白酒釀造過程中微生物種類復(fù)雜多樣，并且不同微生物的數(shù)量也是在不斷變化的。有研究表明，采用傳統(tǒng)可培養(yǎng)的方法能檢測到的環(huán)境微生物僅占總體的1%左右[19]。如果采用傳統(tǒng)微生物的研究方法不能及時有效的反映出白酒釀造過程中不可培養(yǎng)微生物的種類和數(shù)量的變化，而采用實時熒光定量PCR 的方法則可能會得到理想的結(jié)果。采用實時熒光定量PCR 方法的局限在于必須明確所要研究微生物的待擴增序列[20]，進而進行引物設(shè)計，而白酒釀造過程中微生物種類復(fù)雜，想要明確所有微生物的擴增模板，尚存在困難。但是，隨著分子技術(shù)及手段的不斷發(fā)展，這些問題都能夠得到解決。相信在將來，實時熒光定量PCR 技術(shù)在白酒微生物檢測方面將會得到廣泛應(yīng)用。