桑利升,吳 杰,曹雅杰,白 雪,包曉紅,2,*

(1.錦州醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院,遼寧錦州 121000;2.臺州學院醫(yī)學院,浙江臺州 318000)

食管癌是世界第六大癌癥死亡原因[1]。我國食管癌發(fā)病和死亡病例均約占全球的50%,尤其是在中西部農(nóng)村高發(fā)區(qū),食管癌仍是當?shù)鼐用竦闹饕膊∝摀鶾2]。食管癌分為食管鱗狀細胞癌和食管腺癌,我國以食管鱗狀細胞癌為主。手術(shù)是早期食管癌臨床治療中最有效的方式之一,但食管癌早期癥狀常不明顯[3],當在診斷時,有一半的患者存在轉(zhuǎn)移性疾病,而局部區(qū)域性疾病的患者在大多數(shù)病例中發(fā)展為轉(zhuǎn)移性疾病[4]。對于已失去手術(shù)根治機會的中晚期食管癌,化療為其主要姑息治療方案[5]。順鉑聯(lián)合5-氟尿嘧啶(DF化療方案)是臨床治療中晚期食管癌的重要選擇,但受個體差異等因素影響,該方案仍難使部分患者有效獲益[6]。目前,中藥提取物對癌癥的治療成為熱門,因中藥純天然、副作用少,其提取分離的有效成分在生物活性方面具有明顯優(yōu)勢,主要表現(xiàn)在術(shù)后免疫力提高、放化療副作用減輕、腫瘤復(fù)發(fā)抑制和轉(zhuǎn)移減少等方面,這為提高患者的生活質(zhì)量并對生存期的延長有顯著的影響[7]?，F(xiàn)已有臨床研究對卵巢癌晚期患者用中藥進行治療,并且已取得良好的治療效果[8]。目前紫杉醇、長春新堿等已經(jīng)成為臨床常用的植物化療藥,例如三七總皂苷(PNS)在動脈粥樣硬化、糖尿病、急性肺損傷、癌癥和心血管疾病等醫(yī)學研究或應(yīng)用中得到了廣泛的應(yīng)用[9]。此外,各種PNS制劑如注射劑和膠囊,已經(jīng)商品化,并在臨床實踐中得到了廣泛的應(yīng)用[10]。

癌細胞的特征是活性氧含量升高,活性氧主要由線粒體產(chǎn)生[11]。當細胞受到一定的有害刺激時,體內(nèi)的活性氧自由基(ROS)以及活性氮自由基(RNS)等一些高活性的生物分子迅速大量形成,可以誘導(dǎo)組織損傷以及細胞凋亡,存在于動、植物體內(nèi)的超氧化物歧化酶(SOD)具有消除ROS的功能。黃酮具備類SOD的作用,這些成分能有效清除超氧陰離子自由基、羥自由基、DPPH自由基和抑制不飽和脂肪酸的氧化[12]。在現(xiàn)有的研究中,對銀杏中的黃酮類物質(zhì)的研究最充分,其中抑制新生血管的生成和抗自由基是預(yù)防和抑制腫瘤細胞的生長和擴散的重要途徑[13]。蒲公英含有豐富的黃酮,具有較強的清除自由基、抗氧化、抗炎、抗動脈粥樣硬化、細胞保護作用,以及抗菌、消炎、抗腫瘤等多種藥理作用[14]。蒲公英提取物對乳腺癌、宮頸癌、肝癌等中的治療有相關(guān)報道,且治療效果良好[15-17]。但在食管癌治療中的研究報道尚少。因此,本研究探究蒲公英黃酮類醇提物對ESCC細胞增殖、細胞遷移和侵襲的影響,初步分析藥物對細胞遷移和侵襲的作用機制,旨在為食管鱗癌的防治提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

人食管鱗癌細胞(ESCC)株KYSE30、TE-1 南京科佰生物科技有限公司;蒲公英(TaraxacummongolicumHand.-Mazz.)干樣 杭州修正藥店;RPMI1640培養(yǎng)基 美國Hyclone公司;標準胎牛血清 美國Gemini Bio;青霉素-鏈霉素混合溶液 北京Solarbio;胰蛋白酶消化液、CCK-8 北京鼎國昌盛有限公司;BCA定量試劑盒 美國Thermo Scientific公司;抗兔E-Cadherin多克隆抗體、抗兔ZO-1多克隆抗體、抗兔N-Cadherin多克隆抗體 美國Proteintech公司;抗兔Snail-1多克隆抗體 武漢愛博泰克公司;抗鼠β-actin 多克隆抗體、辣根酶標記山羊抗兔IgG HRP 上海優(yōu)寧維公司;山羊多克隆抗體二抗to小鼠IgG-H&L 英國abcam公司;ECL 發(fā)光液、結(jié)晶紫 上海碧云天生物技公司;transwell板、Matrigel基質(zhì)膠 美國康寧公司。

Thermo HERA cell1 50i/240i CO2細胞培養(yǎng)箱 美國Thermo公司;BioTek Synergy H1酶標儀 美國BioTek公司;GE Amersham Imager 600超靈敏多功能成像儀 美國GE公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 蒲公英黃酮類醇提物的獲取 蒲公英干樣利用醇沉法超聲波提取蒲公英黃酮[18],其乙醇質(zhì)量分數(shù)為50%,提取溫度為40 ℃,提取時間為2 h,黃酮含量為6.32%。蒲公英黃酮類醇提物濃度為0.0249 mg/L。

1.2.2 細胞培養(yǎng) KYSE30和TE-1細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和青-鏈霉素各100 U/mL RPMI1640培養(yǎng)基,于37 ℃ 5% CO2恒溫加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用顯微鏡觀察細胞形態(tài)及生長情況,待細胞長至對數(shù)生長期時用于后續(xù)實驗。

1.2.3 細胞增殖能力檢測 消化收集細胞,以5×103cell/孔接種于96孔板,放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入100 μL含不同濃度(0、0.1、0.5、1.0、5.0 μg/mL)的蒲公英黃酮類醇提物的培養(yǎng)基,每個濃度設(shè)4個復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。每個時間段每孔加入20 μL CCK-8,37 ℃孵育3 h,酶標儀上測定450/630 nm處吸光度(A)值,計算其生存率。生存率(%)=加藥組A值/未加藥組A值。

1.2.4 細胞遷移能力檢測 細胞以5×105cell/孔濃度接種于6 孔板,于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜。用移液器吸頭在中間區(qū)域劃痕,棄去培養(yǎng)基并用PBS洗去劃掉的細胞,于倒置顯微鏡下拍照。配制含蒲公英黃酮類醇提物濃度為0(對照組)、0.1、0.5 μg/mL的無血清培養(yǎng)基,加入細胞中繼續(xù)培養(yǎng)24 h,顯微鏡倍數(shù)下100倍拍照記錄細胞遷移情況。實驗重復(fù)3次。用Image J計算劃痕面積。

遷移率(%,以12 h為例)=(0 h劃痕面積-12 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100

1.2.5 細胞侵襲能力檢測 將matrigel基質(zhì)膠從-20 ℃冰箱中取出置于4 ℃待其融化,按照1∶20比例用不含血清的OPTI-MEM培養(yǎng)基稀釋后放入Transwell小室中置于37 ℃培養(yǎng)箱1～2 h待固化。將Transwell上室加入100 μL含5×104cell的無血清細胞懸液和100 μL含不同濃度(0、0.1、0.5 μg/mL)的蒲公英黃酮類提取物的無血清培養(yǎng)基,下室加入500 μL含10%血清的培養(yǎng)液,放置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后取出小室,經(jīng)固定、結(jié)晶紫染色后在400倍顯微鏡下隨機選取5個視野照相,觀察和計算細胞穿過膜的數(shù)量。實驗重復(fù)3次。用Image J計算侵襲細胞數(shù)。

1.2.6 Western Blot檢測侵襲相關(guān)蛋白的表達 細胞以3×105cell/孔濃度接種于6孔板放置培養(yǎng)箱中孵育過夜。不同濃度的蒲公英黃酮類醇提物(0、0.1、0.5、1.0 μg/mL)處理KYSE30和TE-1細胞48 h后,去除培養(yǎng)基,PBS洗滌后,再加入細胞裂解液(含PMSF),冰上放置1 min后12000 r/min、4 ℃離心5 min,取上清。BCA法測其濃度,等量蛋白樣品經(jīng)4%～10%(w/V)不連續(xù)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)后轉(zhuǎn)移至PVDF膜,用含5%脫脂奶粉TBST封閉液封閉2 h,一抗(1∶1000)4 ℃孵育過夜,一抗有:E-cadherin(135 kDa)、N-cadherin(140 kDa)、ZO-1(220 kDa)、Snail-1(29 kDa)和β-actin(42 kDa),以β-actin做對照,TBST清洗3次,每次10 min。再加二抗(1∶10000)室溫孵育1 h,TBST清洗3 次,每次10 min。最后用ECL顯色液進行顯色,拍照。使用Image J軟件分析條帶灰度值。相對表達量(%)=(各蛋白灰度值/β-actin 灰度值)×100。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 蒲公英黃酮類醇提物對ESCC細胞增殖的影響

已有研究發(fā)現(xiàn),蒲公英能夠抑制肝癌細胞的增殖[19]。不同濃度的蒲公英黃酮類醇提物處理ESCC細胞0～72 h后,測細胞的增殖情況,如圖1所示,0.1 μg/mL蒲公英黃酮類醇提物短時間(48 h)內(nèi)促進TE-1細胞增殖,對KYSE30細胞仍起抑制作用,但從0.5 μg/mL濃度開始,細胞生存率明顯下降,濃度高至5 μg/mL時細胞生存率低于20%。這證明蒲公英黃酮類醇取物對食管鱗癌細胞KYSE30和TE-1具有明顯的抑制作用,兩種細胞在蒲公英黃酮類醇提物的作用下都出現(xiàn)了增殖減慢,且都呈現(xiàn)出一定的濃度依賴關(guān)系。蒲公英黃酮類醇提物對食管鱗癌細胞尤其對KYSE30細胞顯著呈現(xiàn)濃度和時間的依賴關(guān)系(P<0.0001)。這種現(xiàn)象可能與黃酮醇取物中的槲皮素等成分有關(guān)[20]。有報道認為黃酮能通過非cGMP依賴途徑抑制人食管癌細胞的增殖并且可能通過下調(diào)Bcl-2的表達和上調(diào)Bax的表達而誘導(dǎo)食管癌細胞發(fā)生凋亡[21-22],因此猜測蒲公英黃酮可能也通過類似的途徑抑制細胞增殖并且增加凋亡。

圖1 蒲公英黃酮類醇提物對ESCC細胞增殖的影響Fig.1 Effect of flavonoids extract from dandelionon the proliferation of ESCC cells注:與對照組相比,****表示加藥組差異高度顯著,P<0.0001;***表示加藥組差異非常顯著,P<0.001;**表示加藥組差異顯著,P<0.01;*表示加藥組差異顯著,P<0.05;圖2～圖4同。

2.2 蒲公英黃酮類醇提物對ESCC細胞遷移能力的影響

遷移是腫瘤細胞轉(zhuǎn)移過程中必不可缺的環(huán)節(jié)之一。腫瘤細胞在遷移刺激物的作用下,產(chǎn)生趨化性及趨觸性遷移,完成向遠離器官的轉(zhuǎn)移[23]。用不同濃度的蒲公英黃酮類醇提物處理KYSE30和TE-1細胞24 h,其遷移能力隨著濃度的增加而下降,如圖2。對照組(0 μg/mL)細胞經(jīng)過24 h的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)后劃痕面積已合攏一半,0.1 μg/mL濃度處理時的KYSE30和TE-1細胞的遷移率分別為19.33%和22.66%(P<0.001),0.5 μg/mL濃度處理時的KYSE30細胞基本遷移率不變,而TE-1細胞遷移率降至18.32%(P<0.01)。因此,蒲公英黃酮類醇提物可有效抑制ESCC細胞遷移,尤其對KYSE30細胞,效果更加明顯,且都呈現(xiàn)出一定的濃度依賴關(guān)系。

圖2 蒲公英黃酮類醇取物對ESCC細胞遷移的影響Fig.2 Effect of flavonoids from dandelion on the migration of ESCC cells注:A和B分別為KYSE30和TE-1的遷移率。

2.3 蒲公英黃酮類醇提物對ESCC細胞侵襲能力的影響

腫瘤的侵襲是惡性腫瘤的主要生物學特征,也是影響治療結(jié)果和預(yù)后的重要因素。用不同濃度的蒲公英同類藥物處理KYSE30和TE-1細胞48 h,其結(jié)果如圖3。對照組細胞經(jīng)48 h大部分已侵襲過膜,而0.1 μg/mL濃度藥物處理后,與對照組相比,只有40.25% KYSE30細胞和51.00% TE-1細胞穿透過膜(P<0.0001),0.5 μg/mL濃度的藥物侵襲能力已大幅降低(KYSE30:68.88%,TE-1:85.46%)(P<0.0001),說明蒲公英黃酮類醇提物抑制食管癌細胞侵襲能力,且呈劑量依賴性。

圖3 蒲公英黃酮類醇提物對細胞侵襲能力的影響Fig.3 Effect of flavonoids extracts of dandelion on the invasion ability of cells 注:A:KYSE30細胞;B:TE-1細胞。

2.4 蒲公英黃酮類醇提物對ESCC細胞侵襲相關(guān)蛋白的影響

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是一種發(fā)生在多種疾病中的病理過程,與腫瘤的進展有較大的關(guān)系。在EMT發(fā)生過程中,上皮細胞失去其基底細胞的極性及細胞與細胞之間的粘附性,獲得間質(zhì)細胞更易侵襲轉(zhuǎn)移的表型,同時細胞失去上皮細胞標志物,如E-鈣黏著蛋白(E-cadherin),而表達間質(zhì)細胞標志物如N-鈣黏著蛋白(N-cadherin)[24]。EMT受到多重水平的調(diào)節(jié),主要是轉(zhuǎn)錄后的修飾,一些轉(zhuǎn)錄因子包括Twist、snail家族等可以觸發(fā)EMT進程,從而促進腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移[25]。為了檢測藥物影響細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力的機制,用不同濃度的蒲公英同類藥物處理KYSE30和TE-1 48 h,通過Western Blot法檢測侵襲遷移相關(guān)蛋白(圖4)。隨著藥物濃度的增加,KYSE30細胞相比對照組E-cadherin表達量增加120%(P<0.001),N-cadherin減少38%(P<0.01),Snail-1和ZO-1表達量分別減少35%(P<0.01)和23%(P<0.05);而TE-1細胞相比對照組E-cadherin表達量增加114%(P<0.05),N-cadherin減少65%(P<0.01),Snail-1和ZO-1表達量分別減少85%(P<0.01)和53%(P<0.05),表示蒲公英黃酮類醇提物通過上調(diào)E-cadherin蛋白表達,下調(diào)N-cadherin、Snail-1和ZO-1蛋白表達,從而有效抑制腫瘤細胞EMT和轉(zhuǎn)移。黃酮類化合物同MAPK抑制劑效果相同,都能通過抑制MAPK信號通路而抑制EMT[26]。

圖4 蒲公英黃酮類醇提物對ESCC的遷移和侵襲相關(guān)蛋白的影響Fig.4 Effects of flavonoids extracts from dandelion on migration and invasion related proteins of ESCC cells注:A和B分別為蒲公英黃酮類醇提物對ESCC細胞侵襲的相關(guān)蛋白的影響;C和D分別為KYSE30和TE-1的相關(guān)蛋白的與Actin表達量比較之后的相對表達量。

3 結(jié)論

本研究通過細胞CCK-8、劃痕和transwell實驗均證實,蒲公英黃酮類醇提物處理食管鱗癌細胞后,均出現(xiàn)明顯的抑制細胞生長,遷移和侵襲現(xiàn)象,且都呈現(xiàn)出一定的濃度依賴關(guān)系,這種現(xiàn)象可能與黃酮醇取物的某些化學成分有關(guān)。蒲公英黃酮類醇提物通過上調(diào)E-cadherin蛋白表達,下調(diào)N-cadherin、Snail-1和ZO-1蛋白表達,從而有效抑制腫瘤細胞EMT和轉(zhuǎn)移。ERK是MAPK家族的一員,是細胞生長和分化調(diào)控的主要參與者。然而,當不適當?shù)丶せ顣r,它會導(dǎo)致惡性轉(zhuǎn)化。ERK信號通路可以改善EMT在體內(nèi)和體外模型中的表達[27]。因此,蒲公英黃酮類醇提物調(diào)節(jié)EMT的機制可能與ERK信號通路有關(guān)。

綜上所述,蒲公英黃酮類醇提物有效抑制食管鱗癌細胞增殖,遷移和轉(zhuǎn)移侵襲能力,為后期活性成分的提取和新藥開發(fā)提供了實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ),也為食管癌的中藥物治療提供有效的實驗數(shù)據(jù)。