王佳燕,劉秀英,*,李學鵬,*,王 昱,王 宇,高 雪,勵建榮,郭曉華,于建洋

(1.渤海大學食品科學與工程學院,生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心,海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心(大連工業(yè)大學和渤海大學),遼寧錦州 121013;2.山東美佳集團有限公司,山東日照 276800;3.榮城泰祥食品股份有限公司,山東威海 264309)

隨著人們生活水平的不斷提高,消費者對食品品質和質量安全的重視程度逐漸提高。魚肉營養(yǎng)豐富,味道鮮美,受到消費者的青睞,但其在酶與微生物的共同作用下極易腐敗變質。因此,如何準確判斷魚肉的新鮮度對消費者顯得尤為重要[1]。

目前魚新鮮度的評價方法主要有感官評價法、微生物法和理化指標檢測法[2-4]。日常消費者主要使用感官評價法對的新鮮度進行評價,其結果具有一定的主觀性。微生物和理化指標檢測法需要進行樣品前處理,耗時長,檢測過程操作復雜[5]。這些方法均無法滿足消費者對魚新鮮度進行實時的監(jiān)測。近年來一些新型檢測技術例如計算視覺、色譜法以及電子鼻等新技術受到研究者們的廣泛關注,并逐漸被應用到魚新鮮度的檢測中[6-8]。然而這些技術存在檢測成本高、需要專業(yè)的檢測設備和技術人員等問題[9-11]。因此,開發(fā)一種快速、實時、無損的魚新鮮度檢測方法具有重要意義,這將有助于消費者在現(xiàn)場直接快速地獲取信息。

智能包裝可以有效的保證包裝產(chǎn)品的品質,延長貨架期,并能夠指示食品的新鮮度[12]。新鮮度指示卡是新型智能包裝的一種,能夠與食品在貯藏過程中產(chǎn)生的特定物質響應產(chǎn)生特征顏色反應引起指示卡的變化,進而判斷包裝內食品的新鮮程度。近年來,國內外學者對食品新鮮度指示卡的研究逐漸增多[13-16]。王冰雪等以溴甲酚紫為指示劑,制備新鮮度指示卡對豬肉新鮮度進行測定,結果顯示該指示卡對不同重量的豬肉均有良好指示效果[17]。Dudnyk等以果膠為基材,以紅甘藍提取物為指示劑,發(fā)明了一種可食用的新鮮度指示卡,指示卡上含有的紅甘藍提取物對pH敏感,與肉或海產(chǎn)品貯藏過程中釋放出的含氮堿性化合物相互作用發(fā)生變色,用肉眼即可對新鮮度進行判斷[18]。然而這些方法均采用單一的指示劑對新鮮度進行指示,存在對新鮮度臨界點判斷靈敏度低的問題。

本文采用溴酚紅和溴甲酚紫兩種指示劑構建雙重指示標簽,以雙重顏色變化為參比對魚的新鮮度進行實時無損的監(jiān)測。提取指示卡的R、G、B值,基于HSV模型,將指示卡的顏色變化與魚的TVB-N值進行關系擬合,進而實現(xiàn)對魚新鮮度的定量分析。以期制備的雙標簽智能指示卡可用于實時無損的監(jiān)測魚新鮮度變化,使消費者能夠更直觀的對魚新鮮度進行現(xiàn)場判斷。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鯉魚(新鮮活魚) 當?shù)厮a(chǎn)市場,均重約1 kg;溴甲酚紫 上海三愛思試劑有限公司;溴酚紅 上海金穗生物科技有限公司;無水碳酸鈉、硼酸、溴甲酚綠 天津化學試劑有限公司;甲基紅 天津市致遠化學試劑有限公司;氯化鉀、甘油、阿拉伯膠、無水碳酸鉀 阿拉丁試劑有限公司。

E-3150型pH計 上海雷磁儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 雙重新鮮度指示標簽的制備 實驗中選取濾紙作為基材,采用浸染吸附的方法對指示劑進行固定,制備指示標簽。雙重指示標簽由外圈指示標簽和內圈指示標簽兩部分構成。外圈指示標簽為溴酚紅(BPR)浸染濾紙,內圈指示標簽為溴甲酚紫(BCP)浸染濾紙。外圈指示標簽的具體制備方法如下:配制濃度為3 mg/mL的溴酚紅乙醇溶液,取一張干凈的濾紙浸入到該溶液中。浸泡12 h后,將濾紙取出,自然干燥。將干燥后的溴酚紅濾紙利用打孔器裁剪成直徑為2 cm的圓形,備用。內圈指示標簽的制備方法同外圈指示標簽的制備方法相似,不同的是用于浸染濾紙的溴甲酚紫乙醇溶液濃度為1 mg/mL,裁剪尺寸為直徑1 cm的圓形。最后將外圈和內圈指示標簽用雙面膠以同心圓的方式拼裝成雙重指示標簽。

1.2.2 指示劑顏色變化分析方法 分別配制濃度為1 mg/mL的溴甲酚紫乙醇溶液和2 mg/mL的溴酚紅乙醇溶液備用。配制pH為2～9的溶液,其中pH2、3、4、5、6為檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液,pH7、8、9為硼砂-硼酸緩沖溶液。量取不同pH緩沖液5 mL置于試管中,向其中各滴加1滴溴甲酚紫或溴酚紅乙醇溶液,混勻。分別對不同pH下指示溶液進行拍照保存,并對拍攝記錄的兩種指示溶液顏色變化進行分析。

1.2.3 雙重指示標簽檢測魚新鮮度 實驗中所用到魚樣均為活魚,購買后將活魚在30 min內運送到實驗室。將魚宰殺后,除去魚的頭尾,去皮剔骨,只保留魚肉作為測試樣品。取魚肉10 g放在10 mL的燒杯中。將按照1.2.1的方法預先制備好的指示標簽粘貼在保鮮膜上。用貼有指示標簽的保鮮膜對裝有魚肉樣品的燒杯進行封口處理,指示標簽面向燒杯內側。將燒杯置于25 ℃恒溫箱中進行儲存,每隔2 h采集一次指示標簽的圖像。每次測試做三個平行樣品。

1.2.4 魚樣揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)的測定 TVB-N的測定方法主要參考國家標準GB/T-5009.228-2016《食品安全國家標準 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》中規(guī)定的微量擴散法[19]。用攪拌機將試樣絞碎攪勻,稱取試樣10 g,加入100 mL去離子水。振搖,使試樣在樣液中分散均勻,浸漬30 min后過濾,所得的濾液備用。

將水溶性膠涂于擴散皿的邊緣,在皿中央內室加入硼酸溶液1 mL及1滴混合指示劑(1∶5的甲基紅乙醇溶液∶溴甲酚綠乙醇溶液)。在皿外室準確加入上述處理后得到的濾液1.0 mL,蓋上磨砂玻璃蓋。然后從縫隙處快速加入1 mL飽和碳酸鉀溶液,立刻平推磨砂玻璃蓋。將擴散皿于(37±1) ℃恒溫箱內放置2 h,取出后放涼至室溫,再用硫酸標準滴定溶液(0.0100 mol/L)滴定,滴定至終點顏色至紫紅色。記錄所消耗的標準滴定溶液的體積,并計算揮發(fā)性鹽基氮的含量。

1.2.5 魚肉pH的測定 pH的測定主要參考國家標準GB 5009.237-2016《食品安全國家標準 食品pH的測定》[20]。用攪拌機將試樣絞碎攪勻,稱取試樣2.0 g,加20 mL的0.1 mol/L氯化鉀溶液,均質。取一定量能夠浸沒或埋置pH計電極的試樣,將電極插入試樣中,將pH計的溫度補償系統(tǒng)調至試樣溫度,測定并記錄讀數(shù)。

1.2.6 新鮮度指示卡顏色變化與TVB-N含量的擬合分析 應用Photoshop軟件,提取所采集照片的RGB數(shù)值。每張圖像在上、中、下三個區(qū)域分別提取RGB,計算平均值。對于顏色不均勻的圖像,分別對圖像邊緣和中心等不同顏色區(qū)域提取RGB值三次,計算平均值。根據(jù)HSV(色調飽和值)顏色模型,計算色調值(H值)[21],計算公式如下:

如果R=max,H=(G-B)/(max-min)×60

式(1)

如果G=max,H=120+(B-R)/(max-min)×60

式(2)

如果B=max,H=240+(R-G)/(max-min)×60

式(3)

如果H<0,H=H+360

式(4)

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗中用Origin 2018b對TVB-N和pH變化趨勢進行分析;利用Photoshop CS5和Powerpoint2017對手機采集的圖像進行處理。

2 結果與分析

2.1 指示劑的顏色變化

為了觀察溴酚紅和溴甲酚紫兩種指示劑的顏色變化趨勢,研究中將兩種指示劑溶解在不同pH的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液中。結果如圖1(a)所示,在pH3～8的范圍內,用于制作外圈指示卡的溴酚紅指示劑顏色從最初明亮的黃色變?yōu)榈S色,再由淡黃色變?yōu)榈凵?最終在pH大于7的情況下變?yōu)榉圩仙?。如圖1(b)所示,用于制作內圈指示卡的溴甲酚紫指示劑顏色在pH3～5的范圍內呈現(xiàn)黃色,并且隨著pH的上升,黃色逐漸變淡。當pH為5時,溴甲酚紫由淡黃色變?yōu)榈仙?隨著pH的進一步升高,紫色逐漸變深。以上顏色變化表明將這兩種指示劑用于指示卡的制備具有一定的可行性。

圖1 不同pH溶液中(a)溴酚紅和(b)溴甲酚紫的顏色變化Fig.1 Color changing of(a)Bromophenol red and(b)Bromocresol purple in different pH solutions

2.2 魚肉TVB-N隨貯藏時間的變化

在室溫貯藏條件下,隨著貯藏時間的延長,由于微生物和酶的作用,魚肉中的蛋白質會分解產(chǎn)生氨和胺類等堿性含氮揮發(fā)性物質,導致TVB-N含量不斷上升。如圖2所示,在貯藏時間低于14 h時,由于微生物增殖和蛋白質分解均比較緩慢,隨著貯藏時間的延長,TVB-N含量緩慢上升。此時魚肉有光澤,顏色均勻,新鮮度良好。在貯藏時間為14 h時,TVB-N的含量為14.3 mg/100 g,接近優(yōu)級品。貯藏16 h后,TVB-N含量迅速上升,在貯藏時間24～26 h之間,TVB-N含量接近合格品臨界點。在貯藏時間超過26 h時,TVB-N的含量高于30.09 mg/100 g,魚肉發(fā)生腐敗。

圖2 魚肉TVB-N隨貯藏時間的變化趨勢Fig.2 Trends of TVB-N value of fish sample

2.3 魚肉pH隨時間的變化

魚體pH的變化與魚的腐敗變質之間存在一定相關性,魚體鮮活時肌肉的pH接近中性,死后由于肌肉中的糖原分解為乳酸,ATP分解產(chǎn)生磷酸,導致pH下降。魚體腐敗后,蛋白質分解后會產(chǎn)生氨及胺類等堿性含氮物質,pH逐漸上升[22]。如圖3所示,隨著貯藏時間的延長,魚肉的pH呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。在貯藏時間低于20 h時,魚肉的pH緩慢降低。在貯藏時間為20 h時,pH從初始的6.78降低到最低點6.63,這與微生物迅速增殖,致使魚肉中大量乳酸積累有關。此時的魚肉的TVB-N含量仍低于國家標準的腐敗臨界點。隨著貯藏時間的繼續(xù)延長,魚肉的pH迅速上升,在28 h時達到6.84,這是魚肉蛋白質分解產(chǎn)生堿性含氮物質所致。

圖3 魚肉pH隨貯藏時間的變化趨勢Fig.3 Trends of pH value of fish sample

2.4 室溫下新鮮度指示卡的顯色效果

圖4表示室溫下貯藏28 h的實際魚樣對雙重指示標簽的顏色變化響應。在室溫下,內圈指示標簽的初始顏色為黃色,在貯藏時間低于14 h時,內圈指示標簽的顏色沒有發(fā)生明顯的變化,14 h時的TVB-N含量為14.3 mg/100 g。參考國家標準GB/T 18108-2019《鮮海水魚通則》的規(guī)定,優(yōu)級品的TVB-N濃度范圍為15 mg/100 g以下,合格品的TVB-N濃度范圍為30 mg/100 g以下[23]。因此,此時的魚樣為優(yōu)級品。隨著貯藏時間的延長,內圈指示標簽的黃色逐漸變暗。在貯藏時間超過26 h時,指示標簽內圈的顏色變?yōu)樽仙?此時的TVB-N含量迅速上升,為30.09 mg/100 g,達到腐敗臨界值,魚肉樣品發(fā)生腐敗,不可食用。與此同時,在魚樣的貯藏過程中,隨著貯藏時間的不斷延長,指示卡外圈顏色由鮮亮的橙色逐漸變?yōu)樽攸S色,在魚肉發(fā)生腐敗后,顏色最終變?yōu)樽仙?。通過新鮮度指示卡顏色變化和相應的TVB-N含量,可以判斷魚的新鮮等級。然而,當使用單重指示標簽指示新鮮度時,通過單一的顏色變化對魚樣的新鮮等級界線區(qū)分不明顯。將兩種指示劑結合,制備雙重指示卡,當內圈和外圈同時變化的情況下判斷魚的新鮮等級更加清晰準確。當魚開始腐敗時,我們可以用肉眼觀察到新鮮度指示標簽的內圈和外圈均變?yōu)樽仙?。因?本研究制備的雙重新鮮度指示標簽檢測魚新鮮度是可行的,可以作為零售商和消費者實時、快速、無損的檢測魚新鮮度的一種有效手段。

圖4 實際魚樣對雙重新鮮度指示卡的顏色變化響應Fig.4 Response of the fish sampleto the color change of the indicator card

2.5 新鮮度指示卡顏色變化與TVB-N含量的擬合分析

TVB-N的含量是評估魚新鮮等級的重要指標之一。色調飽和值(HSV)顏色模型是根據(jù)顏色的直觀特性所創(chuàng)建的一種顏色空間。本研究將TVB-N的含量與色調值(H值)進行相關性擬合分析,進而可以實現(xiàn)根據(jù)指示標簽的顏色變化信息計算實際魚樣TVB-N含量的定量分析。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn),在TVB-N含量低于15 mg/100 g(優(yōu)級品)時,指示標簽外圈的色調飽和度與TVB-N含量存在良好的擬合關系。擬合結果如圖5所示,魚樣在室溫條件下隨著貯藏時間的延長,TVB-N含量不斷上升,相應的H值也逐漸升高。當TVB-N含量低于11 mg/100 g時,H值增加迅速,隨著TVB-N含量的繼續(xù)增加,H值的上升趨于平緩。與此同時,指示標簽外圈的顏色從鮮亮的橙黃色逐漸變暗,最終變?yōu)樽攸S色。將TVB-N含量和H值進行多項式擬合后(擬合曲線如圖4的紅色線所示),得到擬合方程為Y=-53.9463+13.238x-0.48757x2,相關系數(shù)為R2=0.982。相關系數(shù)0.982證明H值和TVB-N含量的擬合關系良好。因此,人們不僅可以通過裸眼判斷魚的新鮮程度,還可以從新鮮度指示標簽的圖像上獲取H值,進而計算魚樣的TVB-N含量。

圖5 H值隨TVB-N含量的變化趨勢Fig.5 Trend of H value with TVB-N content

3 結論

本研究以濾紙為基材,以溴甲酚紫和溴酚紅為指示劑,制備了雙重指示標簽用于魚新鮮度的檢測。溴甲酚紫和溴酚紅兩種指示劑在不同的pH下能呈現(xiàn)良好的顏色變化。魚肉樣品在腐敗變質過程中隨著貯藏時間延長,TVB-N含量增加,魚肉樣品頂空的堿性逐漸增加,致使雙重指示標簽的內圈和外圈都發(fā)生了不同程度的顏色變化。將所制備的雙重新鮮度指示標簽應用于魚新鮮度指示,當實際魚樣貯存時間達到14 h時,指示標簽的內圈的黃色變暗,外圈顏色由鮮亮的橙色變?yōu)闇\棕色,魚樣由優(yōu)極品變?yōu)楹细衿贰．斮A藏時間達到26 h時,指示標簽的內圈和外圈顏色均變?yōu)樽仙?魚樣發(fā)生腐敗?；贖SV模型和TVB-N含量進行關系擬合,擬合度良好,可以進一步通過指示標簽的顏色變化計算魚樣中TVB-N的含量。該研究成果表明利用溴甲酚紫和溴酚紅兩種指示劑制備雙重指示標簽,可以用于對魚新鮮度的指示,且所制備的標簽成本低廉,方便零售商和消費者對魚肉新鮮度的實時監(jiān)測,具有一定的應用潛力。