王妙然，李秋艷，馬學(xué)竹，王旭杰,4，張雪雪,4，張蕊

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是繼發(fā)于糖耐量受損而造成視網(wǎng)膜損害，引起視力下降，甚至黃斑水腫、視網(wǎng)膜脫離及玻璃體出血，最終導(dǎo)致失明的一種疾病。作為一種嚴(yán)重的糖尿病微血管并發(fā)癥[1]，DR 也是糖尿病（diabetes mellitus，DM）最常見的并發(fā)癥之一[2]。DR 發(fā)病機制較為復(fù)雜，是基因和環(huán)境共同作用的結(jié)果?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要從血糖水平及糖尿病病程、高血壓及高血脂、多元醇代謝通路的異常、蛋白質(zhì)非酶糖化產(chǎn)物的堆積、氧化應(yīng)激反應(yīng)增強、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶系統(tǒng)、細胞因子等角度對其發(fā)生機制進行了初步的研究。

根據(jù)DR 的臨床證候，中醫(yī)將本病概括為“視瞻昏渺”“云霧移睛”“暴盲”“血灌瞳神”等范疇[3]。DR發(fā)病源于血瘀損傷眼部絡(luò)脈[3]，呂仁和等[4]認(rèn)為糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生存在血脈瘀滯的病機。文小敏等[5]認(rèn)為瘀血為糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生發(fā)展的主要原因。張亞欣等[6]認(rèn)為消渴病久肝腎陰虛，目失濡養(yǎng)，氣陰虧損、陰虛內(nèi)熱，氣虛無力運血，陰虛血行滯澀，引起眼底脈絡(luò)瘀阻，導(dǎo)致DR 眼底改變；眼底脈絡(luò)瘀阻日久不消則生內(nèi)熱，煉液成痰，或內(nèi)生痰濕，痰瘀互結(jié)，導(dǎo)致新生血管、出血、機化、牽拉等視網(wǎng)膜增殖性病變。

復(fù)方丹參滴丸是在復(fù)方丹參片的基礎(chǔ)上，根據(jù)中醫(yī)傳統(tǒng)理論，采用現(xiàn)代高科技手段研制的一種純中藥滴丸劑，其含有的主要成分包括丹參、三七、冰片的提取物。現(xiàn)已證實復(fù)方丹參滴丸能夠改善DR的癥狀，療效確切[7]。但目前復(fù)方丹參滴丸對DR 的作用機制尚未完全闡明。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)（network pharmacology）是由Hopkins 于2007 年首先提出的[8]，建立在計算機虛擬計算、高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析等技術(shù)基礎(chǔ)上的一種方法，從系統(tǒng)的角度展現(xiàn)中藥成分靶點間的相互聯(lián)系和作用[9]，它能夠整體地分析中藥復(fù)方“多成分”的作用機制，也能獨立呈現(xiàn)某種特定疾病相關(guān)的 “活性成分-靶點-通路”，具有系統(tǒng)性、整體性的特點，與中醫(yī)中藥整體觀、辨證論治的原則相吻合，廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)方及單味藥的作用機制研究中[8,10-11]。本文擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選復(fù)方丹參滴丸活性成分及靶點，分析其治療DR 的關(guān)鍵靶點和信號通路，以期為進一步的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制實驗研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 復(fù)方丹參滴丸化合物及活性成分的篩選

本研究通過中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索復(fù)方丹參滴丸中丹參、三七、冰片所含有的化合物。依據(jù)藥代動力學(xué)中吸收、分布、代謝、排出特性，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和類藥性（drug-likeness，DL）作為篩選指標(biāo)，篩選閾值為OB≥30%，DL≥0.18，篩選出符合條件的活性成分。

1.2 復(fù)方丹參滴丸潛在靶點的反向預(yù)測及篩選

通過并在PubChem 數(shù)據(jù)庫中獲取相關(guān)成分SDF 格式化學(xué)結(jié)構(gòu)，所有化學(xué)結(jié)構(gòu)均采用ChemBio 3D Ultra 軟件轉(zhuǎn)換為Mol2 文件格式，將復(fù)方丹參滴丸化學(xué)成分Mol2 格式結(jié)構(gòu)文件，上傳至PharmMapper 服務(wù)器(http://59.78.96.61/pharmmapper/)，以活性小分子為探針，搜尋潛在藥物靶點，進而得到虛擬篩選和預(yù)測化合物生物活性。參數(shù)設(shè)置如下，Generate Conformers：Yes；MaximumGenerated Conformations：300；Select Targets Set：Human Protein Targets Only(v2010，2241)；Number of Reserved Matched Targets(Max 1 000)：300，所有靶點預(yù)測結(jié)果按Fit score 由高到低進行排序。通過UniProt 數(shù)據(jù)庫中UniProtKB搜索功能(http://www.uniprot.org/)規(guī)范檢索到的藥物靶點的命名，輸入蛋白名稱并限定物種為“人”，將檢索得到的所有“Homo sapiens”靶標(biāo)校正為其官方名稱(official symbol)。

1.3 糖尿病性視網(wǎng)膜病變已知治療靶點獲取

以“Diabetic retinopathy”為關(guān)鍵詞通過Genecard網(wǎng)站（www.genecards.org）檢索與糖尿病性視網(wǎng)膜病變對應(yīng)的靶點，所得靶點即為糖尿病性視網(wǎng)膜病變已知靶點。

1.4 復(fù)方丹參滴丸活性成分靶點與DR 相關(guān)治療靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)

利用String（Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins,Version:11.0，http://string-db.org/) 平臺,選用Multiple proteins 工具,限定物種為“人”,以置信度大于0.4，將DR 的已知治療靶點映射到復(fù)方丹參滴丸的靶點上，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI），并保存其TSV 格式文件。并利用可視化軟件Cytoscape 3.7.2的“Network Analyzer”插件對網(wǎng)絡(luò)進行拓?fù)浞治觯W(wǎng)絡(luò)中節(jié)點（node）之間如存在調(diào)控作用關(guān)系則以邊（edge）相連。拓?fù)渲笜?biāo)為自由度（degree）和介數(shù)（betweenness），二者用于說明網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的重要性，其值越大，則該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中越重要。

1.5 復(fù)方丹參滴丸治療DR 預(yù)測靶點富集分析

采用Metascape 基因聚類在線分析工具庫(http://metascape.org/gp/),基于上述所得到的所有互作靶標(biāo),進行GO 生物分析:選擇數(shù)據(jù)類型為“人”，然后進行Custom Analysis,分別選GO Biological Processes,GO Cellular Components 和GO Molecular Functions。再利用DAVID（http://david.nifcrf.gov/）對網(wǎng)絡(luò)合并后獲得的靶點蛋白進行京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析，以人類全基因組為背景和參照，分析結(jié)果設(shè)置閾值EASE＜0.05，Count≥4，F(xiàn)DR＜0.01，P＜0.01 獲得顯著性較高的生物過程和通路富集分析結(jié)果，點擊通路名稱可以連接到KEGG 數(shù)據(jù)庫查看通路及詳情。

1.6 “活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為了更清晰的展現(xiàn)復(fù)方成分、核心靶點與通路之間的關(guān)系，利用Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建并分析復(fù)方丹參滴丸“活性成分-靶點-通路”的網(wǎng)絡(luò)藥理圖。在網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點表示活性成分、靶點或通路。邊則代表了活性成分、靶點及通路之間的相互作用關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方丹參滴丸化合物、活性成分及潛在靶點的收集與篩選

TCMSP 平臺共收錄丹參化學(xué)成分202 個，符合篩選條件 (OB≥30%，DL≥0.18) 的共有40 個。TCMSP 平臺共收錄三七化學(xué)成分119 個，符合篩選條件(OB≥30%，DL≥0.18)的共有7 個。TCMSP 平臺共收錄冰片化學(xué)成分31 個，符合篩選條件(OB≥30%，DL≥0.18)的共有3 個。將符合篩選條件的化學(xué)成分結(jié)合文獻調(diào)研的結(jié)果，復(fù)方丹參滴丸共篩選出50 個有效成分。將復(fù)方丹參滴丸各活性成分在Pharmmapper 中返回的前300 個靶點在作用靶點依據(jù)匹配度由高到低排序。通過向Uniprot 數(shù)據(jù)庫的UniProtKB 搜索功能（http://www.uniprot.org/）中輸入蛋白靶點的名稱并限定物種為“人”，將檢索得到的所有蛋白校正為其官方名稱，即為丹參、三七、冰片活性成分的預(yù)測作用靶點。共對應(yīng)得到丹參426 個，三七386 個，冰片307 個基因靶點。去除重復(fù)后共得到429 個靶點。結(jié)果復(fù)方丹參滴丸中不同活性化合物可作用于相同的靶點，同一個活性化合物也可作用于不同的靶點，這反映了其多成分、多靶點治療DR的作用模式。

2.2 已知DR 治療靶點及與復(fù)方丹參滴丸共同靶點的篩選

從GeneCards（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫中檢索到2366 個DR 有關(guān)的已知治療靶點，按其相關(guān)性評分取≥5 分的靶點821 個。將獲得的靶點與復(fù)方丹參滴丸的潛在靶點交集，歸納得到98個可能相關(guān)聯(lián)的潛在作用靶點（圖1）。將丹參、三七、冰片與對應(yīng)活性成分，活性成分與潛在作用靶點，潛在作用靶點與DR 對應(yīng)關(guān)系以及屬性導(dǎo)入到Cytoscape，建立“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)（圖2）。

圖1 復(fù)方丹參滴丸作用于DR 靶點篩選

2.3 候選靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與拓?fù)浞治?/h3>

基于STRING 數(shù)據(jù)庫得到復(fù)方丹參滴丸活性成分預(yù)測出的98 個靶點的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，包括95個節(jié)點和1047 條邊（圖3）。經(jīng)Cytoscape 3.7.2 軟件可視化并對網(wǎng)絡(luò)進行拓?fù)浞治?，拓?fù)渲笜?biāo)選取自由度大于中位數(shù)的2 倍即38，介數(shù)大于中位數(shù)即0.00362648，拓?fù)渲笜?biāo)分析后得出16 個靶點，作為復(fù)方丹參滴丸治療DR 的關(guān)鍵靶點，按核心程度由高至 低排名為 ALB、AKT1、MMP9、MAPK1、EGFR、MAPK8、CASP3、SRC、CAT、MMP2、NOS3、ESR1、HSP90AA1、HRAS、MAPK14 和PPARG。

圖2 復(fù)方丹參滴丸治療DR 的“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 復(fù)方丹參滴丸治療DR 基因GO 富集分析

圖3 復(fù)方丹參滴丸治療DR 的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

將復(fù)方丹參滴丸活性成分預(yù)測出的98 個作用靶點通過Metascape 生物分子功能注釋系統(tǒng)對鑒別得到靶點進行GO 富集分析，共包括3 個分支，即生物過程 （biological process）、分子功能(molecular function)和細胞組分(cellular component)。其中生物過程細胞遷移的正調(diào)控、無機物反應(yīng)、肽反應(yīng)以及肌細胞增生靶點富集較集中（圖4）。在分子功能中磷酸轉(zhuǎn)移酶活性、醇基受體、輔因子結(jié)合、絲氨酸型肽酶活性、類固醇激素受體活性靶點富集較為集中（圖5）。細胞組分中與囊腔、膜筏、細胞外基質(zhì)、受體復(fù)合物、粘著斑相關(guān)性最大。

2.5 復(fù)方丹參滴丸治療DR 基因KEGG 富集分析

圖4 復(fù)方丹參滴丸治療DR 潛在靶點的GO 生物學(xué)過程分析

圖5 復(fù)方丹參滴丸治療DR 潛在靶點的GO 分子功能分析

KEGG 通路分析共得出108 條通路，以P＜0.01作為指標(biāo)，選取與DR 相關(guān)的通路，共37 條（表1）。信號通路主要涉及到細胞能量代謝、細胞增殖、分化、粘附、遷移，細胞外基質(zhì)分泌、胰島素抵抗、腫瘤細胞新陳代謝、血管新生、免疫炎癥等方面，其中基因數(shù)目＞10 的有29 個條目，通路上靶點越多，指示復(fù)方丹參滴丸在治療DR 時越可能通過該通路發(fā)揮作用。

以PI3K-Akt 信號通路為例，富集的靶點為AKT1、AKT2、HRAS、JAK2、KIT、MET、RAF1、TEK、EGFR、FGF1、FGFR1、HSP90AA1、IGF1R、INSR、IL2、KDR、MAPK1、MAP2K1、NOS3、PIK3CG、PIK3R1、PGF、RAC1，由此可見復(fù)方丹參滴丸治療DR 是通過多通路、多靶點作用來實現(xiàn)的（圖6）。

2.6 “活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)分析

采用Cytoscape3.7.2 軟件構(gòu)建37 條通路的“活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)模型（圖7），黃色菱形代表化合物，綠色三角形代表作用靶點，紅色橢圓形代表通路，以自由度調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點大小，從而直觀顯示網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點的重要程度。由KEGG 分析得到37條通路中，共有59 個靶點，其中對應(yīng)復(fù)方丹參滴丸的50 個活性成分。這37 條通路中有40 個活性成分來自于丹參，7 個活性成分來自于三七，3 個活性成分來自于冰片。其中來源于丹參的化合物較多。在丹參的活性成分中丹參環(huán)庚三烯酚酮（miltipolone）、紫丹參己素（przewaquinone F）、丹參醇A（danshenol A）和紫丹參戊素 （przewaquinone E）的作用靶點最多（自由度=48），接著是化合物紫丹參乙素（przewaquinone B，自由度=47），3α-羥基丹參酮IIA（3α-HyDRoxytanshinone IIA，自由度=47），丹參醇B（danshenol B，自由度=45）。這些活性成分具有較多的作用靶點，可能在復(fù)方丹參滴丸治療DR 的過程中起到較為核心的作用。在作用靶點方面，MAPK1，MAP2K1，PIK3R1，PIK3CG 和MAPK10 的自由度分別為82、79、78、76、70，有較多的活性成分配體。

表1 復(fù)方丹參滴丸治療DR 潛在靶點的KEGG 富集分析

圖6 復(fù)方丹參滴丸治療DR 靶點在PI3K-Akt 信號通路的富集情況。紅框內(nèi)為復(fù)方丹參滴丸治療DR 靶點。AKT:AKT1,AKT2；(2)RTK:KIT,MET,TEK,EGFR,FGFR1,KDR,PGR；(3)GF:FGF1,IGF1R,INSR；(4)RI3K,PIK3CG,PIK3R1；(5)Aas:HRAS；(6)Cytokine:IL2；(7)MEK:MAP2K1；(8)ERK:MAPK1

在37 條通路中自由度較大的有癌癥通路、PI3K-Akt 信號通路、Rap1 信號通路、Ras 信號通路、癌癥中的蛋白聚糖（proteoglycans in cancer）、粘著斑（focal adhesion）、FoxO 信號通路、催乳激素信號通路、VEGF 信號通路、HIF-1 信號通路，自由度分別為30、23、22、22、21、18、17、16、14、13。復(fù)方丹參滴丸高類藥性的活性成分作用靶點分布于不同的代謝通路，相互協(xié)調(diào)。

3 討論

DR 病理機制及發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的過程，各發(fā)病機制或途徑之間關(guān)系復(fù)雜，以多種方式相互作用并導(dǎo)致視網(wǎng)膜的氧化和炎癥損傷。就細胞而言，糖尿病患者的視網(wǎng)膜細胞大多都處于異常狀態(tài)并參與了糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)展。如抑制參與視覺循環(huán)、釋放神經(jīng)遞質(zhì)、調(diào)節(jié)血管功能[12-13]的Müller 細胞中VEGF 的表達可顯著改善糖尿病視網(wǎng)膜病變血管新生[14]以及血管通透性異常[15]。同樣，通過抑制視網(wǎng)膜色素上皮細胞特異蛋白65 的活性來減緩視覺周期活動[16-18]可顯著抑制糖尿病引起的毛細血管滲漏的進展和退變。即使是不屬于視網(wǎng)膜細胞的白細胞[19-20]和干細胞[21]也被認(rèn)為參與了糖尿病視網(wǎng)膜病變血管病發(fā)癥的發(fā)展。就目前研究發(fā)現(xiàn)，沒有任何一條信號通路能完全解釋DR 的發(fā)病機制,也不能靠阻斷單一信號通路而達到治療DR 的效果[22]。

圖7 復(fù)方丹參滴丸治療DR 的“活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

中醫(yī)藥對DR 的作用是從整體出發(fā)的多環(huán)節(jié)、多方位、多靶點的全面治療，并且各個環(huán)節(jié)彼此之間相互聯(lián)系、相互作用、相互影響。但由于中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜多樣，化學(xué)結(jié)構(gòu)不確定，對其治療DR 的藥理機制尚不十分明確，缺乏深入的研究。本文通過檢索文獻與查詢科研成果后總結(jié)發(fā)現(xiàn)如下。

PI3K-Akt 信號通路是介導(dǎo)多種生長因子促存活的重要通路[23]。它的主要作用是對葡萄糖代謝、細胞生長、增殖和分化的過程進行調(diào)控，并可介導(dǎo)下游反應(yīng)[24]。糖尿病時低氧和低血糖可激活PI3K 信號通路，活化的Akt 可引起血管擴張，血管重塑與血管新生[25]。過度的血管生成,導(dǎo)致視網(wǎng)膜病變和腎病。在糖尿病發(fā)生和發(fā)展過程中，持續(xù)的高血糖可能激活PI3K-Akt 細胞信號傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致多種細胞因子（如NF-κB）的合成與釋放量上調(diào)，最終加速了DR的發(fā)生與發(fā)展。

Ras 信號通路被認(rèn)為能有效調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡和癌性轉(zhuǎn)化等過程。Ras 在調(diào)控細胞增殖和生存的網(wǎng)絡(luò)信號途徑中處于中心的位置，而Rap1主要調(diào)控細胞的黏附、細胞間連接形成、細胞的分泌作用與極性[26]。Ras 與Rap1 在決定下游信號通路及受體的結(jié)構(gòu)域上具有顯著的相似性[27]。同Rap1 一樣，都可通過不同的效應(yīng)子按照不同的機制抑制或激活MAPK 通路[28]。MAPK 激活后定位在細胞核，通過磷酸化轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因的表達，決定細胞是增殖還是分裂。

MAPK 信號通路在細胞增殖、凋亡、壞死、炎癥等病理過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[29]。在損傷環(huán)境下，大量的細胞因子和炎癥因子的釋放激活了細胞內(nèi)的MAPK 通路，引起多種下游調(diào)控因子和效應(yīng)分子被激活，從而誘發(fā)炎癥和凋亡[30-31]。炎癥和細胞凋亡是DR 的重要病理反應(yīng)之一，并且往往導(dǎo)致視神經(jīng)細胞的凋亡和壞死，從而影響視網(wǎng)膜損傷后的修復(fù)[32-33]。

FoxO 家族是Fox 基因家族中的一個亞族,為細胞核內(nèi)一種轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和凋亡等過程[34]。它們介導(dǎo)胰島素或胰島素樣生長因子對細胞代謝、生長、分化、氧化應(yīng)激、衰老、自噬和衰老等關(guān)鍵功能的抑制作用。在Fox 家族中的FoxO1廣泛表達于重要的胰島素感應(yīng)器官，主要參與肝臟的糖異生調(diào)節(jié)，調(diào)控胰島素β 細胞的代謝、發(fā)育及增殖，調(diào)控脂肪和肌肉的分化及代謝[35-37]。

血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是最有效的血管生成生長因子之一，并具有增加血管通透性、血管內(nèi)皮細胞遷移、增殖和血管形成等作用[38]。血管在發(fā)育過程中，尖端細胞可感知VEGF 的梯度，導(dǎo)致絲狀偽足形成，并向VEGF 梯度遷移[39]。VEGF 對血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移發(fā)揮重要作用[40]。目前抗VEGF 是眼部血管新生的標(biāo)準(zhǔn)治療策略,該治療策略已被廣泛應(yīng)用于各種視網(wǎng)膜血管疾病,包括DR 和視網(wǎng)膜靜脈阻塞[41]。

HIF-1 信號通路在多種心血管疾病、炎癥、癌癥與急性臟器損傷等過程中發(fā)揮重要作用[42]。HIF-1 蛋白是缺氧狀態(tài)下調(diào)控血管新生的重要分子，缺氧能夠誘導(dǎo)HIF-1 蛋白的表達并通過HIF-1 蛋白與VEGF、EPO 基因啟動子區(qū)域的結(jié)合來啟動VEGF、EPO 的表達[43-44]。同時由于HIF-1α 能調(diào)控VEGF 的表達，進而調(diào)控血管增生[45]。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，發(fā)現(xiàn)復(fù)方丹參滴丸多個活性成分可以作用于同一靶點，單個成分也可以作用于多個靶點，通過多條通路協(xié)同發(fā)揮作用。這都體現(xiàn)出復(fù)方的多成分、多靶點、多通路整體調(diào)整的作用特點。對有效靶點進行KEGG 通路分析后發(fā)現(xiàn)復(fù)方丹參滴丸主要通過PI3K-Akt 信號通路、Ras 信號通路、Rap1 信號通路、MAPK 信號通路、FoxO 信號通路、VEGF 信號通路以及HIF-1 信號通路對糖尿病視網(wǎng)膜病變進行治療調(diào)控。復(fù)方丹參滴丸能通過不同的調(diào)節(jié)方式對相應(yīng)信號通路產(chǎn)生作用來達到對疾病的干預(yù)作用。其對各信號通路的調(diào)節(jié)是十分復(fù)雜的，可能通過細胞能量代謝、細胞增殖、分化、粘附、遷移，細胞外基質(zhì)分泌、炎癥及免疫因子等多種信號通路作用于DR，本研究發(fā)現(xiàn)的主要通路有望成為新的治療DR 的靶點方向，但仍需進一步行相關(guān)研究驗證其具體作用機制。對于何種成分以何種方式作用于具體靶基因與各通路調(diào)節(jié)機制等具體細節(jié)更應(yīng)當(dāng)繼續(xù)加以深入研究。