杜麗娟,蘇秀芳,*,梁翠君

(1.廣西民族師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,廣西崇左 532200;2.廣西高校桂西南特色植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,廣西崇左 532200)

櫻花(Cerasusserrulata(Lindl.))是薔薇科櫻屬的觀賞性植物。櫻花在我國(guó)廣西、福建和云南等地廣泛種植[1]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)櫻花的研究主要集中在形態(tài)特征、栽培技術(shù)、病害防治、園林應(yīng)用等方面[2]。櫻花葉是一種傳統(tǒng)中藥材,有止咳、平喘、宣肺、潤(rùn)腸、解酒、抑制惡性腫瘤等功效[3],據(jù)研究發(fā)現(xiàn),這和櫻花葉內(nèi)的活性成分密切相關(guān),如文飛龍等[4]研究發(fā)現(xiàn)櫻花葉的抗氧化能力與其富含的萜類(lèi)呈正相關(guān),李友偉等[5]確定了櫻花多糖的最佳提取工藝,李飛陽(yáng)等[6]證實(shí)了櫻花葉的抗氧化能力與黃酮含量的關(guān)系。黃酮是一大類(lèi)活性成分的總稱(chēng),具有強(qiáng)抗氧化、消炎、延緩衰老等功效。衛(wèi)強(qiáng)等[3]發(fā)現(xiàn)櫻花葉總黃酮經(jīng)聚酰胺-大孔樹(shù)脂純化后具有較強(qiáng)的抗炎活性,能夠明顯抑制二甲苯致小鼠耳腫脹和降低冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性。吳練中等[7]發(fā)現(xiàn)櫻花葉有效成分總黃酮含量較高,具有持久緩慢降壓作用,且無(wú)毒害作用,可開(kāi)發(fā)成具有保健功能的櫻花葉茶等。

超聲波提取法最早被用于提取曼陀羅葉中的生物堿[8],具有能大大縮短提取時(shí)間、保護(hù)提取物的結(jié)構(gòu)、提高提取物的含量等特點(diǎn)。有學(xué)者將其應(yīng)用于葉黃素[9]、果膠[10]、花青素[11]、胡蘿卜素[12]等物質(zhì)的提取。但是關(guān)于采用超聲波法提取櫻花葉總黃酮類(lèi)化合物的研究鮮有報(bào)道。本研究以櫻花葉為試驗(yàn)材料,利用超聲波提取技術(shù)提取總黃酮,探究出櫻花葉中總黃酮的最佳提取工藝,并評(píng)價(jià)其抗氧化能力,以期為超聲波法應(yīng)用于櫻花葉總黃酮提取、開(kāi)發(fā)與利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

櫻花葉 采自廣西民族師范學(xué)院;蘆丁(BR) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;DPPH(≥97%) 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司;無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、雙氧水、抗壞血酸、硫酸亞鐵、無(wú)水對(duì)氨基苯磺酸、硝酸鋁、亞硝酸鈉、一水檸檬酸、無(wú)水磷酸氫二鈉、石油醚等 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

HZ-2A恒溫水浴鍋 南京南大萬(wàn)和科技有限公司;AR124CN電子天平 奧豪斯儀器上海有限公司;722紫外分光光度計(jì) 上海舜宇恒科學(xué)儀器有限公司;KQ-500DE中文液晶臺(tái)式超聲波清洗器 昆山美美超聲儀器有限公司;DSY-9002高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 永康市九順瑩商貿(mào)有限公司;101電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總黃酮提取 參照許建本等[13]的提取方法對(duì)櫻花葉總黃酮進(jìn)行提取。

櫻花葉干燥→粉碎過(guò)篩→脫色干燥→櫻花葉粉→黃酮提取

櫻花葉干燥:將新采摘的櫻花葉直接用自來(lái)水沖洗干凈,接著用蒸餾水沖洗3遍后,自然晾干,然后放入60 ℃的干燥箱中烘12 h,即可得干燥的櫻花葉。

粉碎過(guò)篩:用粉碎機(jī)將櫻花葉進(jìn)行粉碎,過(guò)60目篩后得櫻花葉粉。

脫色干燥:稱(chēng)取50 g的粉末放入1000 mL的燒杯中,加入100 mL的石油醚,用磁力攪拌器攪拌1 h左右至櫻花葉粉脫色,抽濾去濾液得脫色櫻花葉粉,將櫻花葉粉放于室溫條件下自然晾干,再放入65 ℃的烘箱中干燥4 h,即得櫻花葉粉,放入封口袋保存?zhèn)溆谩?/p>

黃酮提取:精準(zhǔn)稱(chēng)量1.0000 g櫻花葉粉末,放入錐形瓶中,按照一定的提取條件對(duì)黃酮進(jìn)行提取,完成實(shí)驗(yàn)過(guò)程后,抽濾并將濾液定容至100 mL的容量瓶中,即得提取液。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 乙醇濃度對(duì)總黃酮得率的影響 設(shè)置料液比1∶20 (g/mL),超聲功率50 W,提取時(shí)間20 min,提取溫度40 ℃,其他參數(shù)和操作同方法1.2.1,探究不同的乙醇濃度(30%、40%、50%、60%、70%)對(duì)總黃酮得率的影響。

1.2.2.2 料液比對(duì)總黃酮得率的影響 設(shè)置乙醇濃度為50%,超聲功率50 W,提取時(shí)間20 min,提取溫度40 ℃,其他參數(shù)和操作同方法1.2.1,探究不同的料液比(1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 g/mL)對(duì)總黃酮得率的影響。

1.2.2.3 超聲功率對(duì)總黃酮得率的影響 設(shè)置乙醇濃度為50%,料液比1∶30 (g/mL),提取溫度40 ℃,提取時(shí)間20 min,其他參數(shù)和操作同方法1.2.1,探究不同的超聲功率(30、40、50、60、70 W)對(duì)總黃酮得率的影響。

1.2.2.4 提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響 設(shè)置乙醇濃度為50%,料液比1∶30 (g/mL),超聲功率50 W,提取溫度40 ℃,其他參數(shù)和操作同方法1.2.1,探究不同的提取時(shí)間(20、30、40、50、60 min)對(duì)總黃酮得率的影響。

1.2.2.5 提取溫度對(duì)總黃酮得率的影響 設(shè)置乙醇濃度為50%,料液比1∶30 (g/mL),超聲功率50 W,提取時(shí)間40 min,其他參數(shù)和操作同方法1.2.1,探究不同的提取溫度(40、50、60、70、80 ℃)對(duì)總黃酮得率的影響。

1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取乙醇濃度(%)、料液比(g/mL)、超聲功率(W)、提取時(shí)間(min)這四因素的三個(gè)水平,在最佳溫度70 ℃下進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn),以確定櫻花葉粉的總黃酮最佳提取工藝。

1.2.4 總黃酮得率的測(cè)定 參照Aadil等[14]的測(cè)定方法,以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn),制備蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),得到回歸方程為:y=10.85x-0.001,R2=0.9994。精準(zhǔn)移取0.50 mL的櫻花樹(shù)葉總黃酮提取液,放入到25 mL的比色管中,移入0.30 mL 5%的亞硝酸鈉溶液,混勻,室溫條件下靜置6 min,移取0.30 mL10%的硝酸鋁溶液放入比色管中,混勻,室溫條件下靜置6 min,移入4.00 mL 4%的NaOH溶液,用相對(duì)應(yīng)的乙醇溶液定容至25 mL刻度線(xiàn)?；靹?靜置15 min。采用對(duì)應(yīng)的乙醇溶液為空白對(duì)照,在波長(zhǎng)為510 nm處,測(cè)出提取液的吸光度值,總黃酮得率的計(jì)算公式見(jiàn)式(1):

式(1)

式中：C為黃酮的濃度(mg/mL)；V為樣品溶液的體積(mL)； X為稀釋倍數(shù)；M為櫻花葉干粉末的質(zhì)量(mg)。

1.2.5 抗氧化能力的測(cè)定

1.2.5.1 ·OH清除能力的測(cè)定 參照馬玲龍等[15]的測(cè)定方法，移取1 mL櫻花葉總黃酮提取液于比色管中，依次移入9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、8.8 mmol/L H2O2溶液各2 mL，混勻，然后在37 ℃的水浴鍋中反應(yīng)30 min后，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光值，記為A1。在同一條件下測(cè)定櫻花葉總黃酮提取液與FeSO4、水楊酸-乙醇溶液、蒸餾水混合后的吸光值A(chǔ)2以及蒸餾水與FeSO4、水楊酸-乙醇溶液、H2O2溶液混合后的吸光值A(chǔ)0。

以抗壞血酸(VC)做陽(yáng)性對(duì)照，計(jì)算公式見(jiàn)式(2)：

·OH清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100

式(2)

1.2.5.2 DPPH·清除能力的測(cè)定 參照Huang等[16]的測(cè)定方法，配制0.001 mg/mL的DPPH溶液。在比色管中加入DPPH溶液和櫻花葉總黃酮提取液，搖勻，常溫黑暗條件下放置30 min后，在波長(zhǎng)為517 nm處測(cè)吸光值，記為A1。在同一條件下測(cè)定DPPH與無(wú)水乙醇混合后的吸光值A(chǔ)0，以及提取液與無(wú)水乙醇混合后的吸光值A(chǔ)2。以抗壞血酸(VC)為陽(yáng)性對(duì)照。計(jì)算公式見(jiàn)式(3)：

DPPH·清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100

式(3)

1.2.5.3 NaNO2清除能力的測(cè)定 參照王敏等[17]的測(cè)定方法，移取2 mL櫻花葉總黃酮提取液于10 mL的比色管中，依次向比色管中加入5 mL的pH3.0檸檬酸鈉-鹽酸緩沖液、1 mL 100 μg/mL的NaNO2溶液，并用蒸餾水定容至刻度線(xiàn)。于37 ℃的水浴中反應(yīng)1 h后冷卻至室溫。從比色管中移取1 mL液體放入新的10 mL的比色管中，依次加入2 mL 4 mg/mL的對(duì)氨基苯磺酸溶液、1 mL 2 mg/mL的鹽酸萘乙二胺，并用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻靜置15 min后，于波長(zhǎng)為540 nm處測(cè)定吸光度值，記為A。用蒸餾水取代總黃酮提取液，其他操作步驟同上，所測(cè)的吸光度值，記為A0。

配制相同濃度梯度的抗壞血酸(VC)溶液,采用上述方法,與待測(cè)液進(jìn)行對(duì)比。計(jì)算公式見(jiàn)式(4):

NaNO2清除率=(A0-A)/A0×100

式(4)

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)重復(fù)測(cè)定三次,取均值,采用Origin 8.5、SPSS 19.0軟件進(jìn)行圖片繪制和數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對(duì)櫻花葉總黃酮得率的影響 由圖1可見(jiàn),當(dāng)乙醇濃度在30%～50%之間時(shí),隨著乙醇濃度的升高,總黃酮得率隨之增加,當(dāng)乙醇濃度為30%時(shí),總黃酮得率低至7.37%,當(dāng)乙醇濃度在40%～60%時(shí),總黃酮得率變化不大,乙醇濃度為50%時(shí)總黃酮得率出現(xiàn)最大值,此時(shí)總黃酮得率為12.41%。在乙醇濃度大于50%時(shí),總黃酮得率隨乙醇濃度的增大而緩慢下降,原因可能是乙醇濃度過(guò)高時(shí),其他脂溶性物質(zhì)、黏性物質(zhì)大量溶出,與可溶性總黃酮形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,影響總黃酮的析出,最終導(dǎo)致總黃酮得率下降,喬孟等[18]在研究過(guò)程中也出現(xiàn)了類(lèi)似現(xiàn)象。因此選取乙醇濃度為50%時(shí)作為總黃酮提取的最適宜濃度。

圖1 乙醇濃度對(duì)總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol volumefraction on total flavonoids yield

2.1.2 料液比對(duì)櫻花葉總黃酮得率的影響 圖2表明,料液比在1∶20～1∶30 g/mL的范圍內(nèi),總黃酮得率呈上升趨勢(shì)。當(dāng)料液比為1∶30時(shí)出現(xiàn)高峰值,得率高達(dá)14.21%,當(dāng)料液比超過(guò)1∶30時(shí),乙醇溶液相對(duì)于固體樣品的體積量越大,總黃酮得率呈下降趨勢(shì)。當(dāng)料液比較低時(shí)乙醇溶液較少,不利于總黃酮的溶解,當(dāng)料液比過(guò)高時(shí),雜質(zhì)溶出的幾率增加,從而導(dǎo)致總黃酮溶解量下降,同時(shí)造成資源的浪費(fèi)[19]。由此可見(jiàn),提取櫻花葉總黃酮的料液比以1∶30為宜。

圖2 料液比對(duì)總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ratio of materialto liquid on total flavonoids yield

2.1.3 超聲功率對(duì)櫻花葉總黃酮得率的影響 由圖3可見(jiàn),總黃酮的得率隨超聲功率的增大呈先上升再下降的趨勢(shì)。當(dāng)功率在30～50 W的范圍內(nèi),總黃酮得率隨著功率的增大而上升,當(dāng)功率為50 W時(shí)達(dá)到一個(gè)高峰,此時(shí)的總黃酮得率高達(dá)13.88%。功率超過(guò)50 W后,總黃酮得率隨功率的增大出現(xiàn)明顯的下滑,這是由于超聲波功率過(guò)大會(huì)導(dǎo)致總黃酮類(lèi)化合物遭到破壞,故選取50 W為適宜超聲功率。

圖3 超聲功率對(duì)總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on total flavonoids yield

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)櫻花葉總黃酮得率的影響 由圖4表明,隨著提取時(shí)間的增加,總黃酮的得率呈現(xiàn)出先升高再降低的規(guī)律,當(dāng)提取時(shí)間在20～40 min內(nèi),總黃酮得率隨時(shí)間的增加而升高,當(dāng)提取時(shí)間為40 min時(shí)出現(xiàn)一個(gè)高峰值,此時(shí)的總黃酮得率高達(dá)13.76%,當(dāng)提取時(shí)間大于40 min后,總黃酮得率隨著提取時(shí)間的增加而降低,這可能是因?yàn)闀r(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致部分的總黃酮被氧化或分解,使總黃酮得率下降,這一點(diǎn)和孫晶等的研究一致[20]。因此,櫻花葉總黃酮的最佳提取時(shí)間為40 min。

圖4 提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on total flavonoids yield

2.1.5 提取溫度對(duì)櫻花葉總黃酮得率的影響 圖5結(jié)果表明,當(dāng)提取溫度在40～70 ℃的范圍內(nèi),總黃酮得率隨溫度的增大而呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì),當(dāng)提取溫度達(dá)到70 ℃時(shí),總黃酮得率最高,高達(dá)13.78%,當(dāng)溫度高于70 ℃后,總黃酮得率會(huì)隨著溫度的升高而降低,這是因?yàn)闇囟冗^(guò)高會(huì)導(dǎo)致熱穩(wěn)定性較弱的總黃酮分解[21],黃酮苷發(fā)生水解,黃酮苷元聚合,羥基氧化,苯環(huán)破壞,進(jìn)而影響活性發(fā)揮,從而降低總黃酮得率,該現(xiàn)象在杜仲葉黃酮的研究中也出現(xiàn)類(lèi)似的結(jié)果[22]?；诖?櫻花葉總黃酮的最佳提取溫度選取70 ℃為宜。

圖5 提取溫度對(duì)總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of extraction temperatureon total flavonoids yield

2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在提取溫度為70 ℃時(shí),選取乙醇溶液的濃度、料液比、超聲波功率、提取時(shí)間四個(gè)影響因素。按照表1設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn),得出櫻花葉總黃酮得率,結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

表2 櫻花葉總黃酮提取正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experimenton extraction of total flavonoids from Cerasus leaf

表2、表3的數(shù)據(jù)表明,四個(gè)因素對(duì)櫻花葉總黃酮得率的影響順序是:乙醇濃度>料液比>超聲功率>提取時(shí)間,其中乙醇濃度對(duì)櫻花葉總黃酮的得率呈顯著影響(P<0.05),料液比、超聲功率和提取時(shí)間均未達(dá)到顯著影響(P>0.05)。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果,櫻花葉總黃酮最佳提取工藝為A3B3C2D3,即乙醇濃度為60%,料液比為1∶35 g/mL,超聲功率為50 W,提取時(shí)間為50 min,提取溫度70 ℃。按最佳提取工藝條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn),測(cè)得黃酮得率分別為14.79%、14.65%、14.79%,平均值為14.74%,高于表2中正交試驗(yàn)中最高得率14.47,表明正交試驗(yàn)優(yōu)選得出的工藝條件具有可靠性。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test

2.3 櫻花葉總黃酮提取液的抗氧化能力

2.3.1 櫻花葉總黃酮對(duì)·OH清除能力的測(cè)定 由圖6可以得出,總黃酮提取液質(zhì)量濃度在0.4 mg/mL時(shí)·OH的清除率較低(為31.87%),隨著質(zhì)量濃度的不斷升高,清除率呈明顯的上升趨勢(shì)[23],其對(duì)·OH的清除能力隨著質(zhì)量濃度的增大而加強(qiáng)。在0.4～1.2 mg/mL的濃度范圍之間,總黃酮提取液對(duì)·OH的清除能力略低于抗壞血酸(VC)。當(dāng)櫻花葉總黃酮濃度為1.2 mg/mL時(shí),對(duì)·OH的清除率達(dá)到79.12%,經(jīng)過(guò)兩者的對(duì)比,表明櫻花葉總黃酮具有較良好的抗氧化活性。

圖6 櫻花葉總黃酮對(duì)·OH的清除能力Fig.6 The ·OH scavenging ability oftotal flavonoids in the Cerasus leaf

2.3.2 櫻花葉總黃酮對(duì)DPPH·清除能力的測(cè)定 由圖7可以得出,櫻花葉總黃酮以及抗壞血酸(VC)的濃度不斷增大,對(duì)DPPH·的清除能力也不斷提高,王芳等[24]提取菠蘿皮總黃酮也出現(xiàn)同樣規(guī)律。當(dāng)櫻花葉總黃酮濃度為0.50 mg/mL時(shí),對(duì)DPPH的清除率達(dá)到94.60%,接近抗壞血酸對(duì)DPPH·清除的能力(97.50%)。

圖7 櫻花葉總黃酮對(duì)DPPH·清除能力Fig.7 The DPPH· scavenging ability oftotal flavonoids in the Cerasus leaf

2.3.3 櫻花葉總黃酮對(duì)NaNO2清除能力的測(cè)定 由圖8可知,質(zhì)量濃度范圍在0.20～1.40 mg/mL之間時(shí),櫻花葉總黃酮提取液對(duì)亞硝酸鈉的清除率隨著濃度的增大而呈明顯的上升趨勢(shì),當(dāng)櫻花葉樣品濃度為1.40 mg/mL時(shí),對(duì)亞硝酸鈉的清除率達(dá)到66.55%,說(shuō)明櫻花葉總黃酮具有一定的抗氧化能力。

圖8 櫻花葉總黃酮對(duì)亞硝酸鈉清除能力Fig.8 NaNO2 scavenging ability oftotal flavonoids in Cerasus leaf

3 結(jié)論

以櫻花葉為研究對(duì)象,采用超聲波法提取櫻花葉總黃酮,并對(duì)其抗氧化能力進(jìn)行探究,通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)總黃酮的最佳提取工藝條件為:乙醇濃度60%、料液比1∶35 g/mL、超聲功率50 W、提取時(shí)間50 min、提取溫度70 ℃,此條件下,櫻花葉總黃酮的得率高達(dá)14.74%。櫻花葉總黃酮提取液的質(zhì)量濃度越大,對(duì)·OH、DPPH·以及亞硝酸鈉的清除能力就越強(qiáng)。當(dāng)櫻花葉總黃酮的質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL時(shí),對(duì)·OH的清除能力為79.12%,當(dāng)櫻花葉總黃酮的質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí),對(duì)DPPH·的清除能力為94.60%,當(dāng)櫻花葉總黃酮的質(zhì)量濃度為1.4 mg/mL時(shí),對(duì)NaNO2的清除能力為66.55%,表明櫻花葉具有較強(qiáng)的抗氧化能力,可開(kāi)發(fā)成具有抗氧化作用的保健食品。