姜辰昊,高增明,王 偉,孫天穎,余世鋒,王存堂

(齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,黑龍江齊齊哈爾 161006)

淀粉資源豐富,是一種可再生和生物降解的天然資源,是食品工業(yè)和化學(xué)工業(yè)重要的原材料[1]。玉米淀粉是可利用的最廉價(jià)的淀粉,其具有較好的流變和凝膠特性,通常將其在糊化后被用作增稠劑、黏合劑、穩(wěn)定劑等[2]。然而,糊化后的淀粉在降溫過(guò)程中易發(fā)生回生現(xiàn)象,導(dǎo)致淀粉類(lèi)產(chǎn)品在存儲(chǔ)期間出現(xiàn)硬度增加、黏度降低、抗酸解、脫水等回生現(xiàn)象,促使其品質(zhì)變劣、貨架期縮短[3]。在工業(yè)上,淀粉要經(jīng)過(guò)各種物理或化學(xué)改性以防止發(fā)生回生現(xiàn)象。物理改性法主要包括濕熱處理、擠壓、微波和高靜水壓處理等方法,然而這些物理方法一般成本較高,不適宜大規(guī)模應(yīng)用;化學(xué)修飾法主要包括對(duì)淀粉進(jìn)行乙?；?、琥珀?；约傲姿峄确椒?但是許多用于食品的化學(xué)修飾對(duì)人體健康不夠安全[4]。因此,針對(duì)回生問(wèn)題,研究者大多采用添加抗淀粉回生的食品添加劑,如黃原膠、環(huán)糊精、海藻酸鈉,與淀粉溶液混合其親水性端插入直鏈淀粉分子形成螺旋配合體,影響淀粉分子重排微環(huán)境,從而延緩淀粉重結(jié)晶,達(dá)到抑制回生的目的[3-5]。同時(shí)有研究表明將單、雙糖在淀粉糊化的過(guò)程中添加,因?yàn)閱坞p糖的分子較小,能夠隨水滲透并進(jìn)入淀粉內(nèi)部,也可達(dá)到抑制淀粉重結(jié)晶的目的,從而抑制淀粉回生[6]。此外,將原花青素、茶多酚等多酚類(lèi)物質(zhì)添加到淀粉中,也可有效抑制回生作用,其原因可能是淀粉和酚類(lèi)化合物的羥基形成氫鍵,從而干擾貯存過(guò)程中淀粉多聚物鏈自身的結(jié)合所致[7-8]。

葡萄籽是葡萄加工產(chǎn)業(yè)中的副產(chǎn)物之一,富含多酚類(lèi)等活性物質(zhì),具有較強(qiáng)的抗氧化作用[9]。葡萄籽乙醇提取物(Ethanol extract of grape seed,EEGS)是從葡萄籽中提取的一種多酚類(lèi)物質(zhì),其多酚含量在95%以上,EEGS包含單體酚和聚合多酚,單體酚主要是兒茶素、表兒茶素、沒(méi)食子酸及兒茶素、表兒茶素的沒(méi)食子酸酯等[10-11]。目前對(duì)葡萄籽多酚類(lèi)物質(zhì)的研究集中在抗氧化成分結(jié)構(gòu)鑒定、抗氧化活性、抗菌活性評(píng)價(jià)以及抗慢性退行性疾病方面。然而葡萄籽中原花青素作為主要生物活性成分,其提取物對(duì)玉米淀粉回生的影響研究未見(jiàn)報(bào)道。葡萄籽作為葡萄加工業(yè)的副產(chǎn)品,若能將其開(kāi)發(fā)利用,不僅可以保護(hù)環(huán)境、節(jié)約資源,而且能夠增加添葡萄籽的附加值,創(chuàng)造良好的經(jīng)濟(jì)與社會(huì)效益。

因此,本文欲詳細(xì)地研究EEGS對(duì)玉米淀粉回生的影響,采用掃描電鏡(SEM)、傅立葉紅外光譜儀(FTIR)X-射線(xiàn)衍射(XRD)、差示掃描量熱儀(DSC)、分別測(cè)定EEGS與玉米淀粉的相互作用,研究EEGS對(duì)淀粉體外消化性的影響,并進(jìn)一步分析EEGS對(duì)玉米淀粉回生的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄籽 甘肅祁連葡萄酒業(yè)有限責(zé)任公司;玉米淀粉 市售;α淀粉酶(20000 U/mL,)、糖化酶(100000 U/g)、乙醇、無(wú)水醋酸鈉、冰醋酸、3,5二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、重苯酚、氫氧化鈉、亞硫酸鈉 均為分析純,天津凱通化學(xué)試劑公司。

YB-2500A多功能粉碎機(jī) 永康市速鋒工貿(mào)有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;TG20-WS高速離心機(jī) 北京京立離心機(jī)有限公司;2.5LfreezePrysystem真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Labconco公司;SYJ-4數(shù)顯示電熱恒溫水浴鍋 天津市歐諾儀器儀表有限公司;MLS-3751-PC高壓滅菌鍋 長(zhǎng)沙市匯虹化玻儀器設(shè)備有限公司;STA449F3同步熱分析儀 德國(guó)耐馳有限公司;Specdrum紅外光譜儀 美國(guó)PE公司;X射線(xiàn)衍射儀 德國(guó)BRUKER-AXS有限公司;UV-5100紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;S-3400掃描電子顯微鏡 蘇州佐藤精密儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葡萄籽乙醇提取物(EEGS)的制備 稱(chēng)取葡萄籽300 g進(jìn)行粉碎,加入600 mL 70%乙醇室溫下浸提2 h后,過(guò)濾取濾液。將濾渣再次進(jìn)行上述提取過(guò)程,合并兩次濾液。將濾液在50 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),之后經(jīng)冷凍干燥后得到的粉末即為EEGS,將EEGS儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱中備用。

1.2.2 淀粉樣品的制備取 玉米淀粉10 g,分別加入占淀粉干重0%、2.5%、5%、10%的EEGS混合,并加入20 mL水后在121 ℃下糊化20 min。將糊化后樣品放入4 ℃冰箱內(nèi)分別貯存5、10、15 d后,將樣品凍干后研磨,過(guò)120目篩后,備用。

1.2.3 回生玉米淀粉顆粒電鏡掃描 對(duì)回生15 d的玉米淀粉樣品進(jìn)行電鏡掃描。掃描電壓10.00 kV,電流 64.0 μA。將不同的樣品做好記錄,平穩(wěn)地固定于直徑1.0 cm的樣品臺(tái)上,噴金鍍膜,在掃描電子顯微鏡下,分別用800、10000的放大倍數(shù)、不同角度進(jìn)行觀察拍照[12]。

1.2.4 回生玉米淀粉的紅外光譜測(cè)定 采用傅里葉紅外光譜儀對(duì)回生15 d的玉米淀粉樣品進(jìn)行測(cè)定。準(zhǔn)確稱(chēng)取1 mg樣品與150 mg KBr進(jìn)行混合,充分研磨壓片制樣,進(jìn)行紅外光譜掃描,測(cè)量范圍為4000～400 cm-1,掃描次數(shù)為16次,分辨率4 cm-1。并通過(guò)所得數(shù)據(jù)計(jì)算1047/1022的比值間接代表回生程度的大小[13]。

1.2.5 回生玉米淀粉XRD射線(xiàn)衍射的測(cè)定 采用全自動(dòng)X射線(xiàn)衍射儀對(duì)回生15 d的玉米淀粉進(jìn)行晶型進(jìn)行掃描,采用銅靶測(cè)定[14]。條件電壓40 kV,衍射角的旋轉(zhuǎn)范圍為5～30 °,掃描速度為2.0 °/min,步長(zhǎng)0.02 °,結(jié)果用Origin 8.5進(jìn)行積分計(jì)算相對(duì)結(jié)晶度。

1.2.6 回生玉米淀粉的熱力學(xué)性質(zhì)測(cè)定 采用差式掃描量熱儀法對(duì)回生玉米淀粉的熱力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定[15]。使用前用標(biāo)準(zhǔn)銦對(duì)DSC進(jìn)行校準(zhǔn),取2～3 mg樣品放在鋁制坩堝中,用微量進(jìn)樣器加入4～6 μL的蒸餾水后壓樣并平衡24 h,以空坩堝做空白,升溫范圍為20～200 ℃,載氣為氮?dú)?從DSC熔融曲線(xiàn)中讀取起始溫度T0,峰值溫度TP,及終止溫度Tc。通過(guò)Origin 8.5軟件進(jìn)行積分計(jì)算各個(gè)樣品的糊化焓值。

1.2.7 回生玉米淀粉體外消化能力測(cè)定 混合酶液的配制:稱(chēng)取糖化酶(100000 U/g)2 g和α淀粉酶溶液(20000 U/mL)5 mL同時(shí)溶于100 mL蒸餾水中離心取上清液即為混合酶液。

稱(chēng)取淀粉樣品100 mg,加入pH5.2的醋酸緩沖溶液25 mL,37 ℃水浴5 min,加入5 mL預(yù)熱好的混合酶溶液,在540 nm下測(cè)20和120 min吸光度值,以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品,做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),方程式為y=1.6134x-0.0832,R2=0.9991,根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算淀粉在20和120 min生成還原糖的含量[16]。

快消化淀粉(RDS)%=[(G20-FG)/TS]×0.9×100

慢消化淀粉(SDS)%=[(G120-G20)/TS]×0.9×100

抗性淀粉(RS)%=[(TS-G120)/TS]×0.9×100

式中,G20為酶水解20 min后產(chǎn)生的葡萄糖含量(mg);FG為酶水解處理前淀粉中游離葡萄糖含量(mg);G120為酶水解120 min后產(chǎn)生的葡萄糖含量(mg);TS為樣品中總淀粉含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)結(jié)果均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用SPSS 11.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,并進(jìn)行Duncan’s差異顯著性分析和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 EEGS對(duì)回生玉米淀粉微觀結(jié)構(gòu)的影響

通過(guò)電鏡掃描,可以從微觀層面觀察EEGS對(duì)玉米淀粉顆粒表面結(jié)構(gòu)所造成的影響,如圖1所示。由圖1a圖1c可以看出,在回生15 d后,對(duì)照組的玉米淀粉表面是不規(guī)則的粗糙多孔結(jié)構(gòu)。而加入2.5%的EEGS的淀粉表面結(jié)構(gòu)平整,粗糙度降低。這可能是由于冷藏條件下的回生玉米淀粉,在冷凍干燥時(shí)水分升華,對(duì)照組的不規(guī)則多孔結(jié)構(gòu)就是由于孔洞內(nèi)水分損失造成的。而添加EEGS的淀粉分子的羥基與提取物中的含有大量羥基的黃酮類(lèi)物質(zhì)的羥基形成氫鍵,從而在冷凍升華干燥后仍然能夠保持較為光滑的表面形態(tài)[12]。

圖1 EEGS對(duì)回生玉米淀粉微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Scanning electronic micrographs showing theinfluence of EEGS on microstructure of corn starch注:a,c:對(duì)照組;b,d:添加2.5%提取物;a,b放大倍數(shù)為800×,c,d放大倍數(shù)為10000×。

2.2 EEGS對(duì)玉米淀粉紅外光譜的影響

糊化后的淀粉儲(chǔ)存在較低的溫度下,由于其處于熱力學(xué)不穩(wěn)定狀態(tài),無(wú)序的支鏈淀粉鏈重新定向排列、內(nèi)部水分逐漸喪失,從無(wú)序結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)橛行蚪Y(jié)構(gòu),且分子間結(jié)構(gòu)越有序,淀粉回生程度越大[17]。Goodfellow等通過(guò)對(duì)淀粉結(jié)構(gòu)分析指出可以用紅外光譜800～1200 cm-1之間吸光度比值表征淀粉的短程有序性,其中1022 cm-1處與淀粉無(wú)定形區(qū)域相關(guān),而1047 cm-1與淀粉有序程度相關(guān)[18]。Flores等用吸收峰1047/1022處吸光度比值來(lái)確定結(jié)晶區(qū)域的有序性,因此1047/1022吸光度的比值可以代表淀粉回生程度的大小[19]。

EEGS對(duì)玉米淀粉回生性質(zhì)影響的紅外光譜如圖2所示。

圖2 EEGS添加量對(duì)玉米淀粉紅外光譜的影響(回生15 d)Fig.2 Effects of EEGS concentrations on theFTIR spectra of corn starch after retrogradation for 15 d

從表1可知,在添加不同濃度EEGS的作用下,回生15 d的玉米淀粉在1047/1022處表征的吸光度值均有所下降,表明EEGS可抑制玉米淀粉的回生。而添加2.5%的EEGS玉米淀粉,其1047/1022吸光度的比值從對(duì)照組的1.11下降到了1.06,下降幅度較大,說(shuō)明添加2.5%的EEGS對(duì)玉米淀粉回生有最佳的抑制效果。

表1 EEGS添加量對(duì)1047/1022比值的影響(回生15 d)Table 1 Effects of EEGS concentrations on the 1047/1022ratio values of corn starch after retrogradation for 15 d

2.3 EEGS對(duì)玉米淀粉XRD射線(xiàn)衍射圖的影響

XRD分析測(cè)定的是不同EEGS添加量時(shí)玉米淀粉樣品在回生后的最終重結(jié)晶情況。而當(dāng)?shù)矸刍厣?16.9 °(2θ)處有很強(qiáng)的吸收峰,這是B-型結(jié)晶典型的特征[17]。當(dāng)添加不同濃度的EEGS后,淀粉回生樣品在16.9 °(2θ)處的衍射強(qiáng)度均有所下降,說(shuō)明EEGS的添加可有效抑制玉米淀粉的的回生。這可能是由于黃酮類(lèi)物質(zhì)含有大量的羥基,可以通過(guò)非共價(jià)相互作用與直鏈淀粉或者支鏈淀粉的部分分支之間發(fā)生相互作用,限制了淀粉分子之間的重結(jié)晶,從而抑制淀粉的回生過(guò)程[20]。

圖3 EEGS添加量對(duì)回生玉米淀粉XRD射線(xiàn)衍射圖的影響(回生15 d)Fig.3 Effects of EEGS concentrations on theX-ray diffraction of corn starch after retrogradation for 15 d

根據(jù)表2中淀粉相對(duì)結(jié)晶度的結(jié)果可以看出,添加不同濃度的EEGS的淀粉相對(duì)結(jié)晶度均有所下降。添加2.5%的EEGS的淀粉相對(duì)結(jié)晶度比對(duì)照組下降了13.15%,但是添加量增大到5%和10%時(shí),回生淀粉樣品的相對(duì)結(jié)晶度反而高于添加量為2.5%時(shí)的樣品,但是相對(duì)結(jié)晶度依然低于對(duì)照組。說(shuō)明EEGS的添加量與玉米淀粉相對(duì)結(jié)晶度下降并沒(méi)有濃度依賴(lài)關(guān)系,添加量為2.5%時(shí)可達(dá)到較好的抑制回生的效果。

表2 EEGS添加量對(duì)玉米淀粉相對(duì)結(jié)晶度的影響(回生15 d)Table 2 Effects of EEGS concentrations on therelative crystallinity of corn starch after retrogradation for 15 d

2.4 EEGS對(duì)玉米淀粉的熱力學(xué)性質(zhì)的影響

淀粉的熔融焓值代表在與水共熱的條件下,解開(kāi)淀粉分子中雙螺旋結(jié)構(gòu)能量的大小,其本質(zhì)是親水性的羥基基團(tuán)與支鏈淀粉的側(cè)鏈相互作用,并在不同程度上結(jié)合到淀粉顆粒的無(wú)定形區(qū)域,從而改變結(jié)晶區(qū)和無(wú)定形基質(zhì)之間的耦合力[16]。如表3所示,回生5 d,EEGS的添加對(duì)淀粉的熔融焓值的影響是顯著的,且隨著濃度的增加淀粉的熔融焓值呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。添加2.5%、5%、10%的EEGS的淀粉的熔融焓值分別比對(duì)照組均有所下降,回生10和15 d淀粉的熔融焓值依然呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì),且隨著回生天數(shù)的增加熔融焓值也在不斷上升。這可能是由于回生程度的增大導(dǎo)致分子間氫鍵的作用力逐漸增強(qiáng),破壞分子內(nèi)部雙螺旋結(jié)構(gòu)越來(lái)越困難。但不論在5、10、15 d中,添加2.5%的EEGS的淀粉都能保持最低的回生程度。

表3 不同濃度的EEGS對(duì)回生玉米淀粉的熱力學(xué)性質(zhì)的影響Table 3 Effects of EEGS concentrations on the gelatinization thermal properties of corn starch after retrogradation

2.5 EEGS對(duì)玉米淀粉體外消化的影響

由表4可知,隨著EEGS添加量的增加,玉米淀粉中快消化淀粉(RDS)含量下降,慢消化淀粉(SDS)和抗性淀粉(RS)的含量增加,并呈現(xiàn)濃度依賴(lài)關(guān)系。當(dāng)EEGS添加量為10%時(shí),與對(duì)照組相比,在4 ℃回生5 d的玉米淀粉中的RDS下降了63.79%,SDS和RS分別增加了約2倍和14倍。此外,隨著回生時(shí)間的延長(zhǎng),對(duì)照組中玉米淀粉中的RDS的含量下降較快,而隨著EEGS的添加量增大,玉米淀粉中RDS的含量下降趨勢(shì)明顯減緩,這也說(shuō)明EEGS的添加抑制了玉米淀粉的回生過(guò)程。這可能由于EEGS中原花青素的多羥基結(jié)構(gòu)形成較多的氫鍵,同時(shí)淀粉的顆粒表面被原花青素的多羥基結(jié)構(gòu)緊緊包圍,減少了酶對(duì)淀粉消化作用的表面積[21]。從而阻止酶對(duì)淀粉的水解位點(diǎn)所致,韋冷云也發(fā)現(xiàn)向淀粉中添加一定比例的菊糖,淀粉的水解率會(huì)有一定程度的降低[22]。

表4 不同濃度的EEGS對(duì)回生淀粉的體外消化性質(zhì)的影響Table 4 Effects of EEGS concentrations on digestive properties of corn starch after retrogradation

3 結(jié)論

將EEGS(富含多酚類(lèi)物質(zhì))添加到玉米淀粉中,其回生焓值、相對(duì)結(jié)晶度、1047/1022的比值均明顯降低,回生后的玉米淀粉微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,均說(shuō)明EEGS對(duì)玉米淀粉的回生有抑制作用。EEGS的添加量對(duì)回生的抑制程度有明顯影響,添加2.5%的對(duì)回生的抑制效果較好。此外,EEGS的添加促使玉米淀粉的消化體外消化性能下降,快消化淀粉含量下降、慢消化淀粉、抗性淀粉含量增加。EEGS可作為玉米淀粉回生抑制劑、抗性淀粉生產(chǎn)的添加劑的潛在來(lái)源,在食品加工中被開(kāi)發(fā)利用。