葉 軍， 韓山山， 盧盺奕， 商玉濤， 馮志強(qiáng),

1 安徽醫(yī)科大學(xué)空軍臨床學(xué)院 肝膽外科， 合肥 230032； 2 空軍特色醫(yī)學(xué)中心 肝膽外科， 北京 100142；3 安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院創(chuàng)新藥物研究所， 合肥 230032； 4 北京朝陽急診搶救中心 普通外科， 北京 100122

microRNA-18a upregulates the regulatory immune function in patients with chronic hepatitis B through the PPARα/γ signaling pathway

YEJun,HANShanshan,LUXinyi,etal.

(DepartmentofHepatobiliarySurgery,ClinicalCollegeofAirforce,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of microRNA-18a (miRNA-18a) on the regulatory immune function in patients with chronic hepatitis B (CHB) through the PPARα/γ signaling pathway.MethodsA total of 98 CHB patients and 96 patients without hepatitis B, who were treated in Air Force Special Medical Center (formerly known as General Air Force Hospital, PLA) from April 2017 to October 2018, were enrolled as experimental group and control group, respectively. There were no significant differences in age and sex between the two groups (P>0.05). RT- PCR was used to measure the relative mRNA expression of miRNA-18a in serum; flow cytometry was used to measure the expression of miRNA-18a in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs); ELISA was used to observe the effect of miRNA-18a on the frequency of CD4+CD25+regulatory T (Treg) cells; Western blot was used to measure the expression of proteins associated with the PPARα/γ signaling pathway. PBMCs were further divided into si-miRNA-18a inhibitor group (transfected with si-miRNA-18a inhibitor) and si-miRNA-18a normal control group (transfected with si-miRNA-18a plasmid); flow cytometry was used to investigate the effect of miRNA-18a inhibition on the frequency of CD4+CD25+Treg cells, and Western blot was used to measure the expression of proteins associated with the PPARα/γ signaling pathway. Thet-test was used for comparison of normally distributed continuous data between two groups, and a Pearson correlation analysis was performed to investigate the correlation between miRNA-18a expression and proteins associated with the PPARα/γ signaling pathway.ResultsCompared with the control group, the experimental group had significantly upregulated mRNA expression of miRNA-18a in serum and liver tissue (t=9.634 and 9.863, bothP<0.01). The experimental group had a significantly higher frequency of CD4+CD25+Treg cells than the control group (t=9.854,P<0.01). Compared with the control group, the experimental group had significantly upregulated levels of interferon-γ and interlukin-9 (t=8.235 and 8.382, bothP<0.05). Compared with the control group, the experimental group had significantly upregulated expression of PPARα and PPARγ (t=4.229 and 3.545, bothP<0.05). Compared with the si-miRNA-18a normal control group, the si-miRNA-18a inhibitor group had a significantly lower percentage of peripheral blood CD4+CD25+Treg cells among CD4+T cells (t=3.968,P<0.01). Compared with the si-miRNA-18a normal control group, the si-miRNA-18a inhibitor group had significantly lower expression of PPARα and PPARγ (t=5.023 and 4.983, bothP<0.05). miRNA-18a was positively correlated with the protein expression of PPARα and PPARγ in the PPARα/γ signaling pathway (r=0.701 and 0.682, bothP<0.05).ConclusionmiRNA-18a may affect the regulatory immune function in CHB patients by activating the PPARα/γ signaling pathway and thus upregulate the frequency of cell surface factors and cytokine secretion levels associated with immune function.

Keywords：hepatitis B, chronic； peroxisome proliferator-activated receptors； microRNAs； T-lymphocytes, regulatory

HBV感染后，HBsAg、HBeAg誘發(fā)并啟動宿主細(xì)胞對HBV不同程度免疫耐受，而CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)在維持免疫耐受中起著決定作用[1-2]。過氧化物酶體增殖物激活受體α/γ(PPARα/γ)信號通路中PPAR有效的參與非酒精性脂肪性肝病的發(fā)病過程，并以脂肪浸潤、肝細(xì)胞損害、炎癥和纖維化為臨床病理表現(xiàn)[3]。microRNA-18a(miRNA-18a)以其廣泛參與生物學(xué)調(diào)控、在各種疾病中表達(dá)均異常等特點成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究新方向[4]，有研究指出，miRNA-18a在肝病的發(fā)生發(fā)展中具有一定的作用[5]，而PPAR信號通路在非酒精脂肪性肝炎的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮了十分重要的作用[6]。但目前miRNA-18a對慢性乙型肝炎患者調(diào)節(jié)性免疫功能的影響缺乏系統(tǒng)性報道，因而本文對miRNA-18a在PPARα/γ信號通路上對慢性乙型肝炎患者調(diào)節(jié)性免疫功能影響的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1 血清和組織來源 抽取來自空軍特色醫(yī)學(xué)中心(原中國人民解放軍空軍總醫(yī)院)肝膽外科2017年4月-2018年10月收治的確診慢性乙型肝炎行肝臟手術(shù)的98例患者為試驗組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)血清 HBsAg和HBeAg陽性超過6個月；(2)符合我國乙型肝炎防治指南[7]的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)肝功能失代償病史者；(2)肝細(xì)胞癌病史者[8]；(3)合并惡性腫瘤患者；(4)合并臟器功能障礙者。另于本院隨機(jī)抽取同期行肝臟手術(shù)非慢性乙型肝炎的96例患者作為對照組。本研究方案經(jīng)空軍特色醫(yī)學(xué)中心倫理委員會審批[批號：空總(科研)第2017-09-YJ 05]，患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器 異硫氰酸熒光素標(biāo)記小鼠抗人CD4抗體(ANT-145)購自艾美捷科技、藻紅蛋白標(biāo)記抗人CD25抗體(561405)購自北京志杰方遠(yuǎn)科技有限公司，引物合成由北京金斯瑞生物科技有限公司完成。人IL-9雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(E-E-H0180c)、人IFNγ ELISA試劑盒、PPARα抗體(PPARα/NR1C1)(yboo978)、PPARγ抗體(PPAR-γ/NR1C3)(ATA35811)均購自美國R&D System公司，流式細(xì)胞分析儀(Attune NXT)購自美國Beckman公司，紫外分光光度計(S-3100)購自深圳邁昂科技有限公司。

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) 分別提取2組患者血清、肝組織中的總RNA。反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后PCR擴(kuò)增檢測2組miRNA-18a mRNA的相對表達(dá)量。按說明書配制PCR反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s、80 ℃延伸10 s，共45個循環(huán)。每個樣本均檢測3次，采用2-△△CT(Livak)方法計算miRNA-18a mRNA相對表達(dá)量[9]。miRNA-18a正向引物：5’-GTGCTAAGGTGCATCTAGTGCAG-3’，反向引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；內(nèi)參U6作為參照基因：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測血清調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞表面因子頻率 采集2組患者外周血，肝素抗凝，經(jīng)Ficoll密度梯度離心法分離獲得外周血單個核細(xì)胞(PBMC)。用抗人CD4和抗人CD25經(jīng)免疫磁珠法從中分離出CD4+CD25+Treg細(xì)胞亞群(純度均>85%)。流式細(xì)胞儀檢測2組患者血清中CD4+CD25+Treg細(xì)胞表面因子頻率，結(jié)果所得流式圖運用Beckman分析軟件處理。

1.5 ELISA檢測相關(guān)細(xì)胞因子分泌水平 采用人IL-9雙抗體夾心ELISA試劑盒、人IFNγ ELISA試劑盒進(jìn)行檢測，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行，每個樣本均設(shè)雙復(fù)孔。

1.6 Western Blot印跡檢測相關(guān)蛋白的表達(dá) 取2組細(xì)胞總蛋白并檢測濃度。制備電泳樣品，12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳，轉(zhuǎn)模，封閉。加入一抗，濃度分別為PPARα 1∶200，PPARγ 1∶400，β-肌動蛋白 1∶1000，4 ℃冰箱過夜，室溫孵育二抗2 h。顯影曝光條帶，每個標(biāo)本重復(fù)3次。

1.7 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將PBMC用DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長到融合度達(dá)到幾乎80%后，用胰蛋白酶處理1 min，每2 d更換一次培養(yǎng)基。將培養(yǎng)的PBMC分為si-miRNA-18a抑制組(轉(zhuǎn)染miRNA-18a 抑制劑)、si-miRNA-18a正常對照組(轉(zhuǎn)染miRNA-18a質(zhì)粒)。提前1天將細(xì)胞以60%的密度接種，使其混勻，第2天當(dāng)細(xì)胞達(dá)到融合度40%的時候進(jìn)行轉(zhuǎn)染。PBS洗滌2次之后每孔加入1 ml的DMEM高糖培養(yǎng)基(含20%胎牛血清)，用去離子水溶解siRNA至20 μmol/L，將siRNA與500 μl無血清DMEM相溶，混勻后靜置，此為A管；將Li-pofectamineTM2000與無血清DMEM混勻后靜置，此為B管，將A、B管混勻靜置20 min后加入各孔中，培養(yǎng)4～6 h后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24～28 h。采用RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染成功即可用于后續(xù)實驗。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 試驗組98例患者中男54例，女44例，平均(60.67±6.91)歲。對照組96例患者中男56例，女40例，平均(61.29±5.73)歲。2組間患者年齡、性別比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)。

2.2 2組miRNA-18a mRNA 表達(dá)水平 RT-PCR結(jié)果顯示，試驗組血清中miRNA-18a mRNA相對表達(dá)量為3.53±0.57，對照組血清中miRNA-18a mRNA相對表達(dá)量為1.22±0.27，2組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.634，P<0.01)(圖1a)。試驗組肝組織中miRNA-18a mRNA相對表達(dá)量為9.24±1.25，對照組肝組織中miRNA-18a mRNA相對表達(dá)量為3.19±0.46，2組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.863，P<0.01)(圖1b)。

注：a，血清；b，肝組織。

2.3 2組PBMC中CD4+CD25+Treg細(xì)胞頻率比較 試驗組CD4+CD25+Treg細(xì)胞頻率為58.77±12.33，對照組CD4+CD25+Treg細(xì)胞頻率為46.68±12.16，2組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.854，P<0.01)(圖2)。

注：a，試驗組；b，對照組。

2.4 2組CD4+CD25+Treg相關(guān)細(xì)胞因子分泌水平 ELISA檢測結(jié)果顯示，試驗組IFNγ分泌水平為27.28±5.44，對照組的IFNγ分泌水平為11.45±2.26，2組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.235，P<0.05)(圖3a)；試驗組的IL-9分泌水平為30.89±5.79，對照組的IL-9分泌水平為12.76±2.53，2組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.382，P<0.05)(圖3b)。

圖3 miRNA-18a對CD4+CD25+Treg相關(guān)細(xì)胞因子分泌水平的影響

2.5 2組PPARα/γ信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平 蛋白電泳結(jié)果顯示，試驗組的PPARα相對表達(dá)水平為0.92±0.11，對照組的PPARα相對表達(dá)水平為0.46±0.06；試驗組的PPARγ表達(dá)水平為0.47±0.05，對照組的PPARγ表達(dá)水平為0.22±0.03。PPARα和PPARγ表達(dá)水平在2組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為4.229、3.545，P值均<0.05)(圖4)。

圖4 2組PPARα/γ信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

2.6 抑制miRNA-18a表達(dá)對CD4+CD25+Treg細(xì)胞占外周血CD4+T淋巴細(xì)胞頻率的影響 si-miRNA-18a抑制組外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞占CD4+T淋巴細(xì)胞的比例為8.5%±2.2 %,si-miRNA-18a正常對照組外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例為11.4%±2.1%, 2組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.968,P<0.01)(圖5)。

注：a，si-miRNA-18a抑制組；b，si-miRNA-18a正常對照組。

圖5抑制miRNA-18a表達(dá)對CD4+CD25+Treg細(xì)胞占外周血CD4+T淋巴細(xì)胞頻率的影響

2.7 抑制miRNA-18a表達(dá)對PPARα/γ信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 si-miRNA-18a抑制組的PPARα和PPARγ表達(dá)水平均明顯較si-miRNA-18a正常對照組低(t值分別為5.023、4.983,P值均<0.05)(圖6)。

圖6 抑制miRNA-18a表達(dá)對PPARα/γ信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.8 miRNA-18a表達(dá)與PPARα/γ信號通路相關(guān)蛋白的相關(guān)性分析 miRNA-18a與PPARα/γ信號通路中的PPARα及PPARγ蛋白表達(dá)水平均呈正相關(guān)(r值分別為0.701、0.682，P值均<0.05)。

3 討論

慢性乙型肝炎是引起全球性關(guān)注的公共衛(wèi)生問題，機(jī)體免疫反應(yīng)因HBV持續(xù)復(fù)制誘發(fā)而啟動，使感染者肝臟及周圍組織受到損害[10-11]。慢性乙型肝炎目前尚無特效治療方法，以藥物控制為主要手段，干擾素類和核苷(酸)類似物為主要涉及物[12-13]。本研究以慢性乙型肝炎患者和非乙型肝炎患者作為研究對象，探究了miRNA-18a通過PPARα/γ信號通路對慢性乙型肝炎患者調(diào)節(jié)性免疫功能的影響。通過RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)在血清和組織中試驗組較對照組的miRNA-18a mRNA表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P值均<0.01)。確定了miRNA-18a 在乙型肝炎中的高表達(dá)，說明miRNA-18a在乙型肝炎發(fā)生發(fā)展中具有一定的作用。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+CD25+Treg細(xì)胞表面因子表達(dá)頻率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)試驗組較對照組的CD4+CD25+Treg細(xì)胞頻率升高(P<0.01)。繼續(xù)采用ELISA法檢測miRNA-18a對CD4+CD25+Treg相關(guān)細(xì)胞因子分泌水平的影響，結(jié)果顯示試驗組IFNγ和IL-9分泌水平均優(yōu)于對照組(P值均<0.05)，提示miRNA-18a對CD4+CD25+Treg相關(guān)細(xì)胞因子分泌具有一定的促進(jìn)作用。最后Western Blot結(jié)果顯示試驗組PPARα和PPARγ表達(dá)水平較對照組均明顯上調(diào)(P值均<0.05)，說明miRNA-18a對慢性乙型肝炎患者調(diào)節(jié)性免疫功能的影響與激活PPARα/γ信號通路有關(guān)。si-miRNA-18a抑制組外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞占CD4+T淋巴細(xì)胞的比例明顯低于si-miRNA-18a正常對照組(t=3.968,P<0.01)。si-miRNA-18a抑制組的PPARα和PPARγ表達(dá)水平均明顯低于si-miRNA-18a正常對照組(P值均<0.05)。而通過相關(guān)性分析，miRNA-18a與PPARα/γ信號通路中的PPARα及PPARγ蛋白均呈正相關(guān)(P值均<0.05)，說明miRNA-18a可能通過PPARα/γ信號通路而對慢性乙型肝炎患者調(diào)節(jié)性免疫功能產(chǎn)生影響。

PPARα屬于核受體家族中的配體激活受體，PPAR與配體結(jié)合并激活后，與視黃醇類X受體(RXR)形成異二聚體，形成的PPAR/RXR異二聚體與靶基因啟動子上游的PPAR反應(yīng)元件結(jié)合，最終調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄[14-15]。PPARα的激動一方面可以通過調(diào)節(jié)其靶基因如固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白、脂肪酸合成酶和低密度脂蛋白的表達(dá)改善脂質(zhì)代謝，另一方面PPARα激活后能夠通過抑制NF-κB的活性從而降低炎癥因子的水平，并且有些PPARa激動劑本身還具有抗氧化作用，進(jìn)一步減輕氧化應(yīng)激，從而減輕肝臟的炎癥反應(yīng)[16-17]。

綜上所述，本研究證明miRNA-18a可以通過激活PPARα/γ信號通路對慢性乙型肝炎患者調(diào)節(jié)性免疫功能產(chǎn)生影響，使其免疫功能相關(guān)細(xì)胞表面因子頻率和細(xì)胞因子分泌水平上調(diào)，該免疫信號通路可能是治療慢性乙型肝炎的一種新策略，但miRNA-18a對CD8+T淋巴細(xì)胞等適應(yīng)性調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的影響還需要進(jìn)一步探究。