黃 雯,仰麗麗,吳付兵

(1.南京醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院腫瘤科，江蘇南京 210000；2.南京市第二醫(yī)院腫瘤科，江蘇南京 210000；3.南京醫(yī)科大學附屬逸夫醫(yī)院腫瘤科，江蘇南京 210000)

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率均逐年上升，每年至少有160萬的新增病例被確診為肺癌，嚴重威脅著人類的健康[1-2]。近年來，雖然大多數(shù)癌癥的生存率穩(wěn)步上升，但肺癌的生存率進展緩慢，由于其發(fā)病過程隱匿，多數(shù)患者在確診時已經(jīng)發(fā)生局部浸潤或轉移，而發(fā)生遠處轉移的患者5年生存率僅為5.0%[3-5]。因此，了解肺癌發(fā)生發(fā)展機制，探索新的診斷或治療靶點成為肺癌領域研究的熱門課題。序列相似性為83的家族A成員(FAM83A)，又稱為BJ-TSA-9，位于染色體8q24上[6]。最近一些研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM83A在肺癌[7-8]、乳腺癌[9]和胰腺癌[10]中異常高表達，很有可能成為這些腫瘤診斷或治療的潛在生物標志物。但FAM83A在肺癌中的臨床意義，以及在肺癌細胞中的生物學作用仍不清楚。本研究旨在探討肺癌患者血清中FAM83A mRNA的表達水平及臨床意義，進一步分析干擾FAM83A表達對肺癌細胞增殖、轉移和侵襲能力的影響，為肺癌的診斷提供新的標志物，也為肺癌的靶向治療提供潛在的靶點。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年8月至2019年8月在南京醫(yī)科大學附屬逸夫醫(yī)院醫(yī)院確診為原發(fā)性肺癌的患者102例為研究對象，其中男58例，女44例，在入組前患者均未接受放療、化療等治療?；颊叩脑\斷和臨床病理特征包括腫瘤大小、TNM分期和淋巴結轉移均經(jīng)過兩位以上病理學醫(yī)生確認。選取同期在醫(yī)院進行體檢的健康人員98例作為對照組，其中男45例，女53例。所有入組人員均簽署知情同意書。所有參與者抽取靜脈血5 mL用于分離血清檢測FAM83A。

1.2儀器與試劑 MTT檢測試劑盒購自上海碧云天公司；Lipofectamine 2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒和定量PCR試劑盒購自Takara公司；Transwell小室和Matrigel膠購自美國BD公司；FAM83A和GAPDH單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；ABI PRISM 7500定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.3方法

1.3.1生物信息學分析FAM83A在肺癌組織中的表達 利用生物信息學在線工具“GEPIA” (http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php)分析FAM83A在肺癌組織和正常組織中的表達。

1.3.2細胞培養(yǎng)與轉染 培養(yǎng)肺癌細胞A549和SK-MES-1，取對數(shù)生長期的細胞按照Lipofectamine 2000轉染試劑說明書轉染si-FAM83A。在轉染中設置siRNA-NC(si-NC)對照組，si-FAM83A-1組，si-FAM83A-2組，熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)確定轉染效率。siRNA序列如下，si-FAM83A-1:5′-GCA CAA CAA CAT CAG AGA CCT-3′；si-FAM83A-2:5′-GAC TGG AGA TTT GTC CTG TCT-3′；si-NC:5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG U-3′。

1.3.3qRT-PCR檢測FAM83A mRNA的表達 Trizol試劑提取各組細胞標本中的總RNA。將RNA逆轉錄成cDNA并進行qRT-PCR檢測。擴增引物序列如下：FAM83A上游引物為5′-CCC ATC TCA GTC ACT GGC ATT-3′，下游引物為5′-CCG CCA ACA TCT CCT TGT TC-3′；GAPDH上游引物為5′-AAT GAA GGG GTC ATT GAT GG-3′，下游引物為5′-AAG GTG AAG GTC GGA GTC AA-3′。以GAPDH作為內(nèi)參，結果以2-ΔΔCt法進行相對定量表示。實驗重復3次。

1.3.4Western blot檢測FAM83A蛋白的表達 提取各組細胞中的總蛋白，BCA法定量蛋白濃度，然后對蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳、轉模、封閉，隨后加入一抗(FAM83A按1∶1 000稀釋，或GAPDH按1∶3 000稀釋)4 ℃反應過夜。TBST漂洗膜3次后加入HRP標記二抗，室溫條件下反應2 h。然后TBST漂洗膜3次，最后用ECL化學發(fā)光試劑盒進行蛋白顯影，化學發(fā)光成像系統(tǒng)成像檢測蛋白質印跡條帶。

1.3.5MTT法檢測細胞增殖 將轉染si-FAM83A或si-NC的肺癌細胞A549和SK-MES-1細胞接種至96孔板中，隨后按MTT檢測試劑盒說明書檢測培養(yǎng)0、24、48、72 h后細胞在570 nm波長下的吸光度，繪制細胞增殖曲線。

1.3.6Transwell實驗檢測肺癌細胞轉移侵襲 轉移實驗：將Transwell小室放置于24孔板內(nèi)，將轉染si-FAM83A或si-NC的肺癌細胞A549或SK-MES-1細胞接種于上室。培養(yǎng)48 h后用4.0%多聚甲醛溶液對小室膜下面的細胞進行固定，然后用0.1%結晶紫染色。各組隨機選取6個視野顯微鏡下觀察拍照并計數(shù)。侵襲實驗：取100 μL Matrigel膠包被Transwell小室底部膜的上室，其余同轉移實驗。

2 結 果

2.1生物信息學分析FAM83A在肺癌組織中的表達 生物信息學“GEPIA”分析結果顯示，與正常組織相比，肺癌組織中的FAM83A相對表達水平明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：與肺癌組織比較，*P<0.05。

圖1 “GEPIA”分析FAM83A在肺癌組織和正常肺組織中的相對表達水平

2.2肺癌患者血清中FAM83A mRNA的表達 qRT-PCR結果顯示，肺癌患者血清中FAM83A mRNA相對表達水平明顯高于體檢健康者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見圖2。

2.3血清中FAM83A mRNA表達水平在肺癌患者中的診斷作用 以血清中FAM83A mRNA表達水平參數(shù)模型作為檢驗指標，繪制診斷肺癌的ROC曲線。FAM83A mRNA表達水平的ROC曲線下的面積分別為0.927(95.0%CI：0.892～0.962)。其中FAM83A mRNA表達水平診斷肺癌的截斷值為2.12時，靈敏度為82.0%，特異度為90.0%。見圖3。

2.4肺癌患者血清中FAM83A mRNA表達水平與化學、臨床病理特征之間的關系 肺癌患者血清中FAM83A mRNA表達水平與年齡之間無明顯相關性，但與腫瘤大小、TNM分期、淋巴結轉移呈顯著相關(P<0.001)。見圖4。

注：與肺癌患者比較，**P<0.01。

圖2 qRT-PCR檢測肺癌患者和體檢健康者血清中FAM83A mRNA表達水平

圖3 血清中FAM83A mRNA表達水平診斷肺癌的ROC曲線

圖4 患者血清中FAM83A mRNA表達水平與臨床病理特征之間的關系

2.5轉染si-FAM83A對肺癌細胞FAM83A mRNA和蛋白表達的影響 將si-FAM83A或si-NC轉染A549和SK-MES-1細胞24 h后，qRT-PCR結果顯示，與si-NC組相比，si-FAM83A組的A549和SK-MES-1細胞中FAM83A mRNA相對表達水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且si-FAM83A-1在A549和SK-MES-1細胞中干擾FAM83A mRNA表達效率高于si-FAM83A-2。Western blot結果顯示與si-NC組相比，si-FAM83A組的A549和SK-MES-1細胞中FAM83A蛋白相對表達水平顯著降低，且si-FAM83A-1在A549和SK-MES-1細胞中干擾FAM83A蛋白表達效率高于si-FAM83A-2。因此，選用si-FAM83A-1(si-FAM83A)轉染細胞進行下一步實驗。

注：A和B分別表示Transwell轉移實驗檢測干擾FAM83A表達對A549和SK-MES-1細胞轉移能力的影響。***P<0.001。

圖5 干擾FAM83A表達抑制肺癌細胞轉移

注：A和B分別表示Transwell侵襲實驗檢測干擾FAM83A表達對A549和SK-MES-1細胞侵襲的影響。***P<0.001。

圖6 干擾FAM83A表達抑制肺癌細胞侵襲

2.6干擾FAM83A表達對肺癌細胞增殖的影響 MTT實驗結果表明，細胞培養(yǎng)24、48、72 h這3個時間點時，與si-NC組相比，轉染si-FAM83A組細胞的吸光度值隨時間延長而逐漸下降，且幅度逐漸增大，其中培養(yǎng)72 h后表現(xiàn)最顯著。在培養(yǎng)72 h后的A549細胞中，與si-NC組細胞的吸光度值(1.307±0.030)相比，si-FAM83A組細胞的吸光度值(0.939±0.030)明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，在培養(yǎng)72 h后的SK-MES-1細胞中，與si-NC組細胞的吸光度值(1.527±0.032)相比，si-FAM83A組細胞的吸光度值(1.234±0.030)明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.7干擾FAM83A表達對肺癌細胞轉移能力的影響 Transwell轉移實驗結果表明，在A549細胞中，與si-NC組視野平均轉移細胞數(shù)(112.000±9.160)相比，si-FAM83A組視野平均轉移細胞數(shù)(34.000±3.300)顯著減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，見圖5。在SK-MES-1細胞中，與si-NC組視野平均轉移細胞數(shù)(138.000±10.410)相比，si-FAM83A組視野平均轉移細胞數(shù)(68.500±4.300)顯著減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

2.8干擾FAM83A表達對肺癌細胞侵襲能力的影響 Transwell侵襲實驗結果表明，在A549細胞中，與si-NC組視野平均侵襲細胞數(shù)(75.300±4.500)相比，si-FAM83A組視野平均侵襲細胞數(shù)(36.830±2.710)顯著減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，見圖6A。在SK-MES-1細胞中，與si-NC組視野平均侵襲細胞數(shù)(115.180±9.500)相比，si-FAM83A組視野平均侵襲細胞數(shù)(58.560±4.310)顯著減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，見圖6B。

3 討 論

肺癌，連同肝癌和結直腸癌是全世界癌癥死亡的三大主要原因，近年來其發(fā)病率呈上升和年輕化趨勢，肺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉移是一個復雜的多基因參與的調(diào)控過程[11-13]。因此，研究肺癌增殖、轉移的分子機制對肺癌的診斷和治療具有重要的臨床意義。

在乳腺癌中FAM83A的表達明顯升高，與乳腺癌的預后顯著相關[14]。在胰腺癌中FAM83A顯著過表達，并與胰腺癌患者的癌癥干細胞數(shù)目及整體生存率呈顯著相關性[10]。還有研究表明FAM83A在肺腺癌和非小細胞肺癌組織中高表達，且和預后明顯相關[7,15]。以上研究表明FAM83A在腫瘤中高表達，且與患者的預后不良密切相關。本研究通過“GEPIA”分析發(fā)現(xiàn)FAM83A在肺癌組織中顯著高表達，進一步在肺癌患者血清中發(fā)現(xiàn)FAM83A mRNA顯著高表達，且與患者腫瘤大小、TNM分期及淋巴結轉移呈明顯相關性，提示血清FAM83A的高表達與肺癌發(fā)展密切相關，提示血清FAM83A可能和肺癌患者的預后不良也相關，該結果和以往的研究結果類似[7,15]。以血清中FAM83A mRNA表達水平進行肺癌診斷時ROC曲線下面積為0.927，最佳截斷值為2.120，具有較高的靈敏度和特異度。以上研究結果表明血清中FAM83A表達能夠作為肺癌的診斷標志物，并和肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。

現(xiàn)有研究雖然都有報道FAM83A的表達，但FAM83A在肺癌中具體發(fā)揮著什么作用仍有許多未知。干擾FAM83A能夠顯著抑制HER2+乳腺癌細胞的增殖，促進其凋亡[16]。還有研究表明在體外和體內(nèi)干擾FAM83A能顯著降低乳腺癌細胞的增殖和轉移能力[9]。本研究發(fā)現(xiàn)干擾FAM83A表達可對A549和SK-MES-1細胞增殖、轉移和侵襲產(chǎn)生明顯的抑制作用，表明干擾FAM83A能夠抑制肺癌的發(fā)生發(fā)展。SHI等[17]報道發(fā)現(xiàn)LncRNA FAM83A-As能顯著提高FAM38A蛋白水平，誘導ERK磷酸化，從而促進肺癌細胞增殖和侵襲。本研究結果與SHI等[17]發(fā)現(xiàn)相似，表明FAM83A在肺癌中發(fā)揮癌基因的作用，提示FAM83A可能成為肺癌治療的潛在靶點。本研究證實FAM83A對肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲起著至關重要的作用，但至于FAM83A影響腫瘤細胞轉移特性的具體作用機制尚不清楚，有待進一步研究。后續(xù)將繼續(xù)在動物體內(nèi)探討FAM83A對腫瘤增殖和轉移能力的影響。

4 結 論

血清中FAM83A mRNA能夠作為肺癌的診斷標志物，同時，干擾FAM83A表達能夠抑制肺癌細胞增殖、遷移和侵襲能力，可為肺癌的預防和治療提供潛在的靶點。