熊 華，馬 婕，崔 森

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院血液科，青海西寧 810001)

慢性高原病(CMS)是一種長(zhǎng)期在高海拔環(huán)境下機(jī)體穩(wěn)態(tài)紊亂所致的慢性疾病狀態(tài)，并產(chǎn)生一系列生理功能改變。機(jī)體長(zhǎng)期暴露于低氧環(huán)境，處于過(guò)度疲勞、睡眠不佳等狀態(tài)，造成機(jī)體各器官功能的減退，甚至發(fā)生高原衰退癥，其發(fā)病機(jī)制目前仍未完全明確。通過(guò)低氧暴露下機(jī)體生理變化的研究，明確了低氧與紅細(xì)胞過(guò)度增加的關(guān)系，過(guò)去的研究主要關(guān)于紅細(xì)胞增殖機(jī)制。近年來(lái)對(duì)CMS患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞凋亡的研究，證明了細(xì)胞凋亡在CMS發(fā)病過(guò)程中的作用。骨髓有核紅細(xì)胞是人體內(nèi)產(chǎn)生紅細(xì)胞的重要來(lái)源，本研究用流式細(xì)胞術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)等實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)CMS患者骨髓有核紅細(xì)胞中Bcl-2家族部分分子的表達(dá)，從而了解CMS骨髓紅系前體細(xì)胞凋亡變化情況，探討B(tài)cl-2家族蛋白在CMS患者紅細(xì)胞過(guò)度增生過(guò)程中的作用，為臨床積累科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年6月至2016年7月就診于本院的26例CMS患者為CMS組，均為漢族男性，平均(50.2±11.4)歲，長(zhǎng)期居住在海拔2 500～4 500 m青藏高原，其診斷符合第六屆國(guó)際高原醫(yī)學(xué)和低氧生理學(xué)術(shù)大會(huì)(中國(guó)西寧，2004年)推薦的CMS診斷標(biāo)準(zhǔn)，平均血紅蛋白(Hb)為(221.90±18.04)g/L，CMS積分為(11.00±1.54)分，并排除急慢性感染、腫瘤、骨髓增殖性腫瘤、免疫相關(guān)性疾病、先天性心臟病及其他原因引起的繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥等。以在同一海拔高度地區(qū)居住時(shí)間接近，并同期在本院體檢的26例體檢健康者為對(duì)照組，均為漢族男性，平均(46.90±13.80)歲，平均Hb為(137.07±17.60)g/L，CMS積分為(2.00±0.72)分，排除心、肺、腎等器官疾病及慢性感染疾病。在性別、年齡、種族等方面兩組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。研究方案征得研究對(duì)象的同意并經(jīng)本院倫理委員會(huì)審議通過(guò)。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集及處理 (1)選取髂后上棘為穿刺點(diǎn)，采集研究對(duì)象骨髓液約5 mL，收集至肝素抗凝管中，用Ficoll密度梯度分離液(美國(guó)Sigma公司)分離出骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNCs)，制成細(xì)胞懸液。(2)經(jīng)研究對(duì)象肘前靜脈抽血4 mL，收集至促凝采血管中，靜置30 min，1 000 g 離心3 min，留取上清液。

1.2.2骨髓有核紅細(xì)胞凋亡檢測(cè) 在細(xì)胞懸液中加入CD71+抗體磁珠(德國(guó)美天旎公司)4 ℃放置15 min，然后400 g離心5 min，棄上清，加入1 mL PBS。重懸沉淀后，400 g離心5 min，棄上清，沉淀重懸于500 μL PBS中。通過(guò)美天旎磁珠分選系統(tǒng)收集CD71+陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算CD71+細(xì)胞數(shù)。并將收集到的1×106個(gè)單個(gè)核細(xì)胞懸浮在100 μL PBS中，管中先后加入APC標(biāo)記的CD71+單克隆抗體10 μL、Annexin V-FITC 5 μL、PI 5 μL，避光孵育5 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，獲取40 000個(gè)細(xì)胞測(cè)定凋亡。

1.2.3qPCR檢測(cè) 提取總RNA，使用Nanodrop 2000測(cè)定總RNA濃度。然后進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。后根據(jù)天根SuperReal熒光定量試劑盒配制20 μL反應(yīng)體系，按反應(yīng)程序進(jìn)行qPCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1CMS組與對(duì)照組骨髓CD71+細(xì)胞凋亡率比較 CMS組骨髓CD71+細(xì)胞凋亡率為2.40%，對(duì)照組骨髓CD71+細(xì)胞凋亡率為2.30%，兩組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.409，P=0.686)。見(jiàn)圖1、2。

表1 CMS組和對(duì)照組Bax、Bcl-xl、Bcl-2 mRNA水平

2.2CMS組與對(duì)照組骨髓有核紅細(xì)胞凋亡相關(guān)mRNA比較 CMS組患者骨髓有核紅細(xì)胞Bax mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CMS組骨髓有核紅細(xì)胞Bcl-2、Bcl-xl mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組有下降趨勢(shì)，但兩組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.3相關(guān)性分析 通過(guò)Pearson積差相關(guān)分析，兩組Hb 與凋亡率、Bax mRNA均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，見(jiàn)表2。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CMS組與對(duì)照組骨髓CD71+細(xì)胞凋亡

圖2 CMS組與對(duì)照組骨髓CD71+細(xì)胞凋亡率比較

表2 CMS組患者骨髓CD71+細(xì)胞凋亡率與凋亡相關(guān)mRNA水平相關(guān)性

3 討 論

根據(jù)本研究的結(jié)果，CMS組骨髓有核紅細(xì)胞Bax mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯下降，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，此結(jié)果與鄒成林等[1]、孫敏敏等[2]研究結(jié)果相同，提示促凋亡蛋白的下降在CMS發(fā)病機(jī)制中具有一定作用。但與其他學(xué)者不一致的研究結(jié)果是CMS組骨髓有核紅細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。研究發(fā)現(xiàn)[3]，大鼠在缺血缺氧狀態(tài)下，隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，其腦部Bcl-2 mRNA的表達(dá)水平與缺氧時(shí)間呈正相關(guān)關(guān)系，但極度的缺血缺氧會(huì)導(dǎo)致Bcl-2 蛋白的表達(dá)水平明顯下降。由此可知，在某些特定條件下，Bcl-2 家族的蛋白水平并不與mRNA的表達(dá)水平一致，其原因可能與Bcl-2轉(zhuǎn)錄調(diào)控的多樣性及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控有關(guān)?，F(xiàn)已有研究證實(shí)在正常的淋巴系統(tǒng)中，小淋巴細(xì)胞一級(jí)淋巴濾泡中Bcl-2的蛋白水平很高，在生發(fā)中心Bcl-2 的mRNA水平很高，但幾乎檢測(cè)不到其蛋白的表達(dá)，證明確實(shí)存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式[4-6]，抑制翻譯進(jìn)行的元件在不影響轉(zhuǎn)錄蛋白的情況下，下調(diào)此蛋白的翻譯水平。在不同的組織，不同的細(xì)胞中，可能存在著不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式。

其次，Bcl-2 家族蛋白成員眾多，其他成員如Bax、Bad、Bik等可以單獨(dú)參與細(xì)胞凋亡調(diào)控，也可以和Bcl-2形成異源或者同源二聚體，使其抑制細(xì)胞凋亡的活性下降，說(shuō)明Bcl-2在細(xì)胞凋亡中的作用不是獨(dú)立的、單一的。研究顯示，形成同源二聚體的Bcl-2和Bax促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但形成異源二聚體的Bcl-2和Bax抑制細(xì)胞凋亡，所以研究Bcl-2/Bax比值的高低變化對(duì)細(xì)胞凋亡更有意義。這一理論在急性白血病患者凋亡調(diào)控基因的相關(guān)研究中得以證實(shí)[7]。同樣，Bcl-2/Bcl-xl可以抑制Bak/Bax，而B(niǎo)ad可以抑制Bcl-2/Bcl-xl，Bid，Bim不僅可以抑制Bcl-2/Bcl-xl，而且可以激活Bak/Bax。Bcl-2家族成員之間的相互作用受到抗體水平和親和力的影響。并且受到許多細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，其機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜[8]。

回顧既往CMS細(xì)胞凋亡機(jī)制相關(guān)的研究，也有很多不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。追溯其原因，其中之一是選取病例的標(biāo)準(zhǔn)、骨髓采集和檢測(cè)方法的差異。在張朝霞等[9]研究中，CMS患者的骨髓組織通過(guò)骨髓活檢術(shù)采集，用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)骨髓組織中Bcl-2、Bcl-xl等蛋白的表達(dá)，與本實(shí)驗(yàn)的標(biāo)本采集來(lái)源、實(shí)驗(yàn)方法均不同。骨髓活檢組織與骨髓液的不同點(diǎn)在于骨髓組織保持了造血組織的天然結(jié)構(gòu)，有核細(xì)胞群集，其內(nèi)分布著各類(lèi)造血細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞，以及多種蛋白、細(xì)胞因子等。Bcl-2 基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究顯示許多生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子可以調(diào)控Bcl-2 的表達(dá)。骨髓活檢所獲取的骨髓組織中內(nèi)容較豐富，可能有目前不可知的某些因素對(duì)Bcl-2 的表達(dá)存在影響。因此，骨髓組織中Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，與本研究單純研究骨髓有核紅細(xì)胞的凋亡蛋白變化之間存在一定差異。陳揚(yáng)揚(yáng)等[10]的研究中將骨髓有核紅細(xì)胞分離出來(lái)后進(jìn)行體外培養(yǎng)，檢測(cè)培養(yǎng)后的有核紅細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，其結(jié)果與本研究的結(jié)論不一致，考慮細(xì)胞離體后相對(duì)于復(fù)雜的機(jī)體，細(xì)胞培養(yǎng)僅僅是一種模擬狀態(tài)，體外細(xì)胞培養(yǎng)很難建立與人體條件接近甚至相似的環(huán)境[11-12]，故體外培養(yǎng)的有核紅細(xì)胞與骨髓液中的有核紅細(xì)胞必然存在差異，這也是結(jié)果不同的原因之一。本研究經(jīng)過(guò)多步驟實(shí)驗(yàn)，最終的研究對(duì)象是CD71+骨髓有核紅細(xì)胞，繼而測(cè)得骨髓有核紅細(xì)胞的Bcl-2家族mRNA表達(dá)水平。CD71是有核紅細(xì)胞表面表達(dá)的重要抗原標(biāo)志之一，特別是在早幼、中幼紅細(xì)胞等紅系前體細(xì)胞中有更高水平的表達(dá)，隨著有核紅細(xì)胞進(jìn)一步分化成熟CD71抗原表達(dá)逐漸下降，成熟紅細(xì)胞表面無(wú)CD71抗原表達(dá)，因此用CD71+細(xì)胞來(lái)代表骨髓有核紅細(xì)胞，具有特異性，亦更有價(jià)值、更可靠[13]。相對(duì)于體外培養(yǎng)的骨髓有核紅細(xì)胞，本研究更接近人體實(shí)際情況。

本研究中CMS組與對(duì)照組外周血Hb與骨髓有核紅細(xì)胞凋亡率及Bax mRNA表達(dá)水平均無(wú)相關(guān)性。此結(jié)論與前期的部分研究結(jié)果有所不同[14-18]，提示在CMS患者發(fā)病機(jī)制中有核紅細(xì)胞及成熟紅細(xì)胞的過(guò)度增殖仍可能是其主要的作用機(jī)制，而骨髓有核細(xì)胞凋亡可能對(duì)紅細(xì)胞的積累有一定的影響，今后還需加大樣本量，建立更加適宜的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ?，選取更可靠的實(shí)驗(yàn)方法，繼續(xù)深入研究。

4 結(jié) 論

本研究以高原地區(qū)常見(jiàn)病CMS患者為研究對(duì)象，具有明顯的地域特色。本研究在既往實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，采用流式細(xì)胞術(shù)及qPCR兩種不同的實(shí)驗(yàn)方法，測(cè)定骨髓CD71+細(xì)胞(有核紅細(xì)胞)凋亡率，結(jié)果更接近實(shí)際情況。該研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前人研究結(jié)果有所不同，可能與標(biāo)本采集、研究方法等因素相關(guān)。在將來(lái)的研究中需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，運(yùn)用多種不同的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行研究，互相印證，取長(zhǎng)補(bǔ)短，進(jìn)而得出更加接近實(shí)際情況的結(jié)論，為CMS的預(yù)防及治療提供可靠的理論依據(jù)，繼而解決高原病所帶來(lái)的社會(huì)問(wèn)題。