尚文雯，徐 睿，陳 獻(xiàn)，姚莎莎，金淑賢，張曉潔△

(1.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)學(xué)部/國(guó)家重點(diǎn)臨床檢驗(yàn)?？平ㄔO(shè)單位，江蘇南京 210029；2.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，江蘇南京 210029)

肺癌的發(fā)病率和病死率位居全球惡性腫瘤之首，發(fā)病率逐年上升。其中，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌的85.00%左右，約75.00%的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已為晚期，5年生存率很低[1]。傳統(tǒng)腫瘤療法包括手術(shù)、化療和放療對(duì)NSCLC的治療效果欠佳，不能有效改善患者的生存期和生活質(zhì)量。近年來(lái)免疫治療包括腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞療法(TIL)、嵌合抗原受體T細(xì)胞療法(CAR-T)、T細(xì)胞受體療法(TCR-T)及免疫卡控點(diǎn)修飾法(CTLA-4、PD-1/PDL1)等免疫治療方法已取得較大進(jìn)展，逐漸應(yīng)用于NSCLC的治療，但由于NSCLC復(fù)雜的腫瘤免疫微環(huán)境，其治療效果與預(yù)期仍有很大差距[2-3]。因此進(jìn)一步深入研究肺癌的免疫抑制微環(huán)境，有助于打破腫瘤形成的免疫耐受，為肺癌的免疫治療提供更為廣闊的前景。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院(下稱本院)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者或家屬均簽署知情同意書。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡20～70歲初診患者，未曾接受過(guò)其他外科手術(shù)、放化療及免疫抑制治療；(2)臨床診斷明確，且均經(jīng)細(xì)胞學(xué)或組織學(xué)病理確診；(3)無(wú)其他惡性腫瘤病史，無(wú)其他嚴(yán)重并發(fā)癥；(4)健康對(duì)照者為同期體檢健康者。本研究根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)收集了2017年7月至2018年10月就診于本院的15例肺癌患者的癌組織及其相應(yīng)癌旁正常組織(距癌>5 cm)，并收集相對(duì)應(yīng)的10例肺癌患者外周血，患者年齡35～70歲，平均61歲；男8例，女7例；其中肺腺癌13例，肺鱗癌2例；根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)第8版肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[4]，Ⅰ期2例，Ⅱ期12例，Ⅲ 期1例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移7例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移8例。同時(shí)收集同期20例年齡匹配的體檢健康者外周血作為健康對(duì)照組，健康對(duì)照組年齡32～70歲，平均58歲；男11例，女9例。

1.2單個(gè)核細(xì)胞制備 外周血用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(TBD，中國(guó))密度梯度離心獲得單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。新鮮的肺癌組織和癌旁正常組織用無(wú)菌外科剪剪碎，加入含有DNase Ⅰ(50 U/mL，Sigma)、透明質(zhì)酸酶(100 μg/mL，Sigma)、膠原酶Ⅳ(1 mg/mL，Sigma)和L-谷氨酰胺(2 μmol/L，Sigma)的RPMI 1640培養(yǎng)基中室溫?fù)u床消化2 h。100 mm篩網(wǎng)(BD Falcon，美國(guó))過(guò)濾后獲得單細(xì)胞懸液，用Percoll細(xì)胞分離液(GE Health Care Life Sciences，美國(guó))梯度離心得到組織浸潤(rùn)的單個(gè)核細(xì)胞。

1.3流式細(xì)胞術(shù) 取1×106個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，加入 Alexa Fluor 750-anti-CD45，Alexa Fluor 700-anti-CD3，BV421-anti-TCRγδ，F(xiàn)ITC-anti-Vδ1和PE-anti-Vδ2流式抗體(Biolegend，美國(guó))，室溫下避光孵育20 min，進(jìn)行細(xì)胞膜表面標(biāo)記，洗滌后加入300 μL PBS重懸細(xì)胞，F(xiàn)ACS Aria Ⅱ(BD Biosciences，美國(guó))流式細(xì)胞儀檢測(cè)。以FSC和SSC定義淋巴細(xì)胞，從CD45+陽(yáng)性門里分析CD3+γδ+T細(xì)胞的比例，并從γδ+T陽(yáng)性門里分析Vδ1 T、Vδ2 T細(xì)胞所占比例。

2 結(jié) 果

2.1肺癌患者外周血γδT細(xì)胞、Vδ1 T細(xì)胞和Vδ2 T細(xì)胞的表達(dá)水平 圖1A、B分別顯示1例健康對(duì)照者和1例肺癌患者外周血中γδT細(xì)胞、Vδ1 T、Vδ2 T細(xì)胞的流式檢測(cè)圖。以健康對(duì)照者為例，其外周血中γδT細(xì)胞比例為2.91%，Vδ1 T細(xì)胞比例為8.97%，Vδ2 T細(xì)胞比例為82.80%。圖1C、D、E顯示γδT細(xì)胞、Vδ1 T細(xì)胞、Vδ2 T細(xì)胞表達(dá)比例的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果。健康對(duì)照組外周血中γδT細(xì)胞比例為(6.87±1.27)%，Vδ1 T細(xì)胞比例為(19.13±3.85)%，Vδ2 T細(xì)胞比例為(66.45±4.65)%；肺癌患者外周血中γδT細(xì)胞(5.87±1.38)%和 Vδ1 T細(xì)胞(11.50±3.70)%的表達(dá)水平與健康對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而Vδ2 T細(xì)胞(23.69±8.84)%表達(dá)水平則顯著低于健康對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2肺癌患者癌組織浸潤(rùn)的γδT細(xì)胞、Vδ1 T細(xì)胞和Vδ2 T細(xì)胞的表達(dá)水平 圖2A、B分別顯示同1例肺癌患者癌組織和癌旁正常組織中γδT細(xì)胞、Vδ1 T、Vδ2 T細(xì)胞的流式檢測(cè)圖。以癌旁正常組織為例，其γδT細(xì)胞比例為25.10%，Vδ1 T細(xì)胞比例為47.90%，Vδ2 T細(xì)胞比例為1.65%。圖2C、D、E顯示γδT細(xì)胞、Vδ1 T細(xì)胞、Vδ2 T細(xì)胞表達(dá)比例的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果。肺癌患者癌旁正常組織中浸潤(rùn)的γδT細(xì)胞比例為(23.25±2.06)%，Vδ1 T細(xì)胞比例為(48.80±4.23)%，Vδ2 T細(xì)胞比例為(4.10±1.34)%；癌組織中浸潤(rùn)的γδT細(xì)胞(32.68±2.83)%和 Vδ1 T細(xì)胞(63.92±4.17)%水平顯著高于癌旁正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而癌組織中浸潤(rùn)的Vδ2 T細(xì)胞表達(dá)水平(1.60±0.53)%則與癌旁正常組織比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3肺癌患者外周血和癌組織中γδT細(xì)胞、Vδ1 T細(xì)胞和Vδ2 T細(xì)胞的分布特征 本文進(jìn)一步比較肺癌患者外周血和癌組織中浸潤(rùn)的γδT細(xì)胞、Vδ1 T細(xì)胞和Vδ2 T細(xì)胞的表達(dá)水平，如圖3A、B、C所示：肺癌患者癌組織中浸潤(rùn)的γδT細(xì)胞[(32.68±2.83)%vs. (5.87±1.38)%，t=7.319，P<0.001)]和 Vδ1 T細(xì)胞[(63.92±4.17)%vs. (11.50±3.70)%，t=8.815，P<0.001)]的水平明顯高于外周血，而Vδ2 T細(xì)胞的水平則明顯低于外周血，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(1.60±0.53)%vs. (23.69±8.84)%，t=3.082，P<0.01)]。

2.4肺癌患者癌組織浸潤(rùn)的γδT細(xì)胞、Vδ1 T細(xì)胞和Vδ2 T細(xì)胞的水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 本文進(jìn)一步將15例肺癌患者分為有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，并比較癌組織中浸潤(rùn)的γδT細(xì)胞、Vδ1 T細(xì)胞和Vδ2 T細(xì)胞的表達(dá)水平，如圖4A、B、C所示：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌患者浸潤(rùn)的Vδ1 T細(xì)胞水平顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(57.87±4.94)%vs. (40.86±5.44)%，t=2.289，P<0.05)]；而浸潤(rùn)的γδT細(xì)胞[(24.79±1.95)%vs. (21.91±3.54)%，t=0.683，P>0.05)和Vδ2 T細(xì)胞的水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(2.50±1.44)%vs. (5.51±2.14)%，t=1.131，P>0.05]。

注：健康對(duì)照組20例，肺癌組10例；***表示P<0.001；ns表示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺癌組和健康對(duì)照組外周血中γδT細(xì)胞、Vδ1 T細(xì)胞和Vδ2 T細(xì)胞的表達(dá)水平

注：癌旁正常組織15例，癌組織15例，***表示P<0.001。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺癌患者癌組織和癌旁正常組織中浸潤(rùn)的γδT細(xì)胞、Vδ1 T細(xì)胞和Vδ2 T細(xì)胞的表達(dá)水平

注：癌組織15例，外周血10例；**表示P<0.01，***表示P<0.001。

圖3 肺癌患者外周血和癌組織中γδT細(xì)胞、Vδ1 T細(xì)胞和Vδ2 T細(xì)胞的表達(dá)水平

注：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移7例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移8例；*表示P<0.05，ns表示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 肺癌患者癌組織浸潤(rùn)的γδT細(xì)胞、Vδ1 T細(xì)胞和Vδ2 T細(xì)胞的水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

3 討 論

γδT 細(xì)胞是一類廣泛分布于外周血和黏膜上皮組織的非組織相容復(fù)合體限制性固有T淋巴細(xì)胞。既往研究表明，γδT 細(xì)胞可以通過(guò)多種機(jī)制介導(dǎo)抗腫瘤免疫效應(yīng)，如釋放穿孔素和顆粒酶介導(dǎo)靶細(xì)胞的凋亡；釋放γ-干擾素等細(xì)胞因子參與抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)；抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用；通過(guò)乙型跨膜糖蛋白(FasL)和腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)途徑發(fā)揮抗腫瘤作用；NK細(xì)胞2D受體(NKG2D)直接識(shí)別并殺傷靶細(xì)胞[5-6]，因此γδT 細(xì)胞具有廣泛的抗腫瘤譜。然而，越來(lái)越多的證據(jù)表明，γδT細(xì)胞既可發(fā)揮細(xì)胞毒效應(yīng)殺傷腫瘤細(xì)胞，又能介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[7]。

據(jù)報(bào)道，不同的γδT細(xì)胞亞群具有不同的免疫效應(yīng)功能，其中Vδ1 T細(xì)胞在上皮性腫瘤中具有免疫抑制作用。RNG等[8]研究發(fā)現(xiàn)，直腸癌組織中浸潤(rùn)的Vδ1 T細(xì)胞比例顯著增高，并與腫瘤分期呈正相關(guān)關(guān)系，而Vδ2 T細(xì)胞比例顯著降低，與腫瘤分期呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，Vδ1 T細(xì)胞具有免疫抑制作用，可以抑制初始CD4+T細(xì)胞的增殖，而Vδ2 T細(xì)胞具有殺傷活性，可以殺傷直腸癌細(xì)胞；MA等[9]研究表明，乳腺癌組織中γδT細(xì)胞的增高是其臨床預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與腫瘤大小、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)后生存時(shí)間等不良臨床結(jié)局相關(guān)，且Vδ1 T細(xì)胞可以抑制初始T細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞的功能，阻滯抗原提呈細(xì)胞DC的成熟來(lái)參與腫瘤免疫抑制[10-11]。LU等[12]研究顯示，Vδ2 T細(xì)胞與ATM/ATR通路聯(lián)合可以增強(qiáng)對(duì)卵巢癌細(xì)胞的殺傷作用。與之相符，本研究發(fā)現(xiàn)，肺癌患者癌組織中以Vδ1 T細(xì)胞的細(xì)胞亞群為主，且γδT細(xì)胞和Vδ1 T細(xì)胞的比例較癌旁組織明顯升高；而外周血中Vδ2 T細(xì)胞顯著降低，說(shuō)明γδT細(xì)胞的兩種不同亞群可能在外周血和腫瘤組織中發(fā)揮著不同的效應(yīng)功能。

腫瘤浸潤(rùn)的γδT細(xì)胞可以通過(guò)募集免疫抑制細(xì)胞等方式幫助腫瘤免疫抑制微環(huán)境的建立，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。乳腺癌細(xì)胞分泌的趨化因子IP-10可招募外周γδT細(xì)胞到腫瘤局部，阻斷IP-10介導(dǎo)的γδT的遷移可以增強(qiáng)腫瘤特異性T細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)[13]。對(duì)結(jié)直腸癌的研究發(fā)現(xiàn)，γδT17細(xì)胞可通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-17A促進(jìn)骨髓來(lái)源的抑制性細(xì)胞(MDSCs)的招募、增殖和存活，幫助維持腫瘤的免疫抑制微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[14]。胰腺癌組織浸潤(rùn)的γδT細(xì)胞通過(guò)抑制αβT細(xì)胞的活化促進(jìn)胰腺癌的進(jìn)展[15]。本研究結(jié)果提示，肺癌患者癌組織中以Vδ1 T細(xì)胞亞群浸潤(rùn)為主，增高的Vδ1 T細(xì)胞與肺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，表明癌組織中浸潤(rùn)的Vδ1 T細(xì)胞可能在促進(jìn)肺癌的病程進(jìn)展中發(fā)揮重要的作用。當(dāng)然，有關(guān)γδT細(xì)胞及其亞群在肺癌組織中表達(dá)及與臨床特征的關(guān)系還需要更大樣本的研究，γδT細(xì)胞及其亞群在肺癌腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮的免疫功能及機(jī)制也值得進(jìn)一步深入探討。

4 結(jié) 論

深入研究γδT細(xì)胞及其亞群可能有助于判斷肺癌患者的免疫狀況及預(yù)后，有望為肺癌免疫檢測(cè)與免疫治療提供潛在的靶點(diǎn)。本文的研究顯示，肺癌患者癌組織表達(dá)高水平的Vδ1 T細(xì)胞，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，可能有望成為肺癌免疫治療的潛在靶點(diǎn)。