葉麗艷，王 玥，宋林鍵，趙 強(qiáng)，楊繼勇，王成彬，羅燕萍△

(1.解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心醫(yī)學(xué)檢驗中心，北京 100853；2.重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院，重慶 401331)

耳道感染是耳鼻喉頭頸外科中一類常見的疾病，病原菌(如真菌或細(xì)菌等)引起的感染是其發(fā)生和發(fā)展的主要因素。耳道感染主要包括外耳道炎和中耳炎，其中中耳炎是臨床上最常見的、影響人群量最大且常造成反復(fù)感染的感染性疾病，久治不愈可影響中耳功能與結(jié)構(gòu)，嚴(yán)重者可導(dǎo)致顱內(nèi)并發(fā)癥的發(fā)生[1]。研究顯示,在引起耳道感染的需氧菌中位于首位的革蘭陰性桿菌為銅綠假單胞菌(Pae)，由于抗菌藥物濫用現(xiàn)象極為普遍，使得Pae的種類與耐藥劑量不斷變化出現(xiàn)強(qiáng)耐藥性[2-5]。目前研究可知Pae耐藥機(jī)制主要為產(chǎn)生抗菌藥物滅活或修飾酶、改變抗菌藥物作用靶位、膜通透性障礙、主動外排系統(tǒng)及形成生物膜[6]。其中形成生物膜導(dǎo)致的耐藥較為普遍[7]，細(xì)菌生物膜給細(xì)菌的生存提供了很強(qiáng)的保護(hù)屏障，絕大多數(shù)的細(xì)菌存在主要生物膜，以此來抵御抗菌藥物的作用[8]。有報道細(xì)菌生物膜與慢性感染關(guān)系密切[9]，而在常見的革蘭陰性菌中，Pae是細(xì)菌中極易形成生物膜的一個菌種[7]，因此，研究耳道感染中Pae的生物膜形成對臨床上常見的耳道感染疾病的治療有很重要的意義。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源 解放軍總醫(yī)院2013年5月至2017年12月耳鼻喉外科耳道感染患者標(biāo)本中分離的Pae 106株，同一患者同一標(biāo)本類型來源選取初次分離株。質(zhì)控菌株為Pae ATCC27853(美國模式培養(yǎng)物集存庫)，接種菌種到營養(yǎng)肉湯中進(jìn)行活化,37 ℃培養(yǎng)18～24 h,備用。

1.2儀器與試劑 實驗儀器：Vitek MS質(zhì)譜儀(生物梅里埃公司，法國)，Vitek 2 Compact全自動細(xì)菌鑒定藥敏儀(生物梅里埃公司,法國)，酶標(biāo)儀(SM-Mk3)，微量移液器，生物安全柜，96孔平底組織培養(yǎng)板，電子分析天平。實驗試劑：胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)，磷酸鹽緩沖液(PBS)，結(jié)晶紫(2.00%)，乙醇(95.00%)，無菌生理鹽水，葡萄糖分析純粉末，殼聚糖季銨鹽粉末。

1.3方法

1.3.1分離培養(yǎng)、鑒定、藥敏 臨床樣本按《全國臨床檢驗操作規(guī)程》進(jìn)行分離培養(yǎng),采用法國生物梅里埃公司Vitek MS質(zhì)譜儀進(jìn)行菌種鑒定，采用Vitek 2 Compact GN09藥敏卡進(jìn)行藥敏試驗。

1.3.2生物膜形成能力測定 參照文獻(xiàn)[10]，利用96孔平底組織培養(yǎng)板中Pae所形成的生物膜經(jīng)結(jié)晶紫染色后，使用酶標(biāo)儀檢測570 nm下的吸光度(A)值(每株細(xì)菌包括3個平行孔，每個96孔平底組織培養(yǎng)板包括3個空白對照)，并記錄。同樣參照文獻(xiàn)所述方法根據(jù)A值對每株P(guān)ae生物膜形成能力進(jìn)行等級劃分。Ac=3×A空白對照標(biāo)準(zhǔn)差+A空白對照平均值。

在96孔平底組織培養(yǎng)板上構(gòu)建Pae生物膜，并通過結(jié)晶紫染色、酶標(biāo)儀測定對生物膜形成能力進(jìn)行定量與定性分析，并且分析生物膜形成能力與Pae耐藥性之間的關(guān)系。

1.3.3生物膜形成影響因素 隨后選取11.10 mmol/L葡萄糖和15.00 μg/mL殼聚糖季銨鹽加入到生物膜形成因素研究中，探究這兩種因素是否與生物膜形成有關(guān)。

1.3.4生物膜形成能力的分級判定 生物膜形成情況按照參考文獻(xiàn)[10]方法進(jìn)行分級判定：0級(A≤Ac)，無成膜能力；1級(Ac

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用MiniTab17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,采用χ2檢驗,細(xì)菌耐藥數(shù)據(jù)分析應(yīng)用Whonet 5.6軟件,按照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)2016-M100的折點標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1病例資料分析

2.1.1性別、年齡分布 在106例由Pae引起的耳道感染病例中，男31例，女75例。年齡分布以41～50歲為主，占23.60%，見表1。

表1 病例的性別、年齡分布

2.1.2耳道感染病例復(fù)發(fā)情況 在106例由Pae引起的耳道感染病例中，復(fù)發(fā)患者64例，未復(fù)發(fā)患者42例，復(fù)發(fā)率為60.38%。

2.2生物膜形成情況 在106株P(guān)ae中，形成生物膜的菌株占80.20%；生物膜形成能力以1級為主(46.20%)；復(fù)發(fā)病例分離的菌株中可形成生物膜的菌株比例(81.25%)高于未復(fù)發(fā)病例分離的菌株(78.57%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.3抗菌藥物敏感度分析

2.3.1不同生物膜形成能力菌株的藥物敏感性分析 引起耳道感染的Pae對常見抗菌藥物的敏感率均在50.00%以上(除氨曲南47.17%外)，其中阿米卡星最高(94.34%)，其次是頭孢吡肟(88.68%)、頭孢他啶(86.79%)、美羅培南(80.19%)、亞胺培南(75.47%)。不同生物膜形成能力的Pae在臨床常見抗菌藥物中的藥物敏感率雖然沒有明顯差異，但產(chǎn)生物膜菌株的亞胺培南、頭孢他啶和左氧氟沙星敏感率比未產(chǎn)膜菌株敏感率略高，見表3。

表2 106株P(guān)ae生物膜形成能力情況

表3 生物膜形成能力及不同生物膜級別菌株的藥物敏感率比較

2.3.2復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組分離菌株的藥物敏感率比較 復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組菌株的抗菌藥物敏感率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，復(fù)發(fā)組的頭孢他啶、亞胺培南、美羅培南、左氧氟沙星、哌拉西林、氨曲南和頭孢哌酮/舒巴坦的抗菌藥敏感率略高于未復(fù)發(fā)組，見表4。

表4 復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組分離菌株的藥物敏感率比較

續(xù)表4 復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組分離菌株的藥物敏感率比較

2.4生物膜形成的影響因素分析 在生物膜構(gòu)建的環(huán)境中分別加入11.10 mmol/L葡萄糖及15.00 μg/mL殼聚糖季銨鹽后測定Pae生物膜形成情況，并與原始生物膜形成結(jié)果進(jìn)行比較。

2.4.1生物膜形成A值變化比較 11.10 mmol/L葡萄糖可以促進(jìn)生物膜的形成，A值平均增加1.843；而15.00 μg/mL殼聚糖季銨鹽可起到一定的抑制作用，A值平均降低1.936。

2.4.2生物膜形成能力等級變化比較 11.10 mmol/L葡萄糖可以使73.60%的菌株生物膜形成能力提升，以等級上升1級為主(44.30%)，上升3級的較少(0.90%)；15.00 μg/mL殼聚糖季銨鹽對50.00%的菌株起到了抑制生物膜形成的作用，其中以下降1級為主(37.70%)。

3 討 論

耳道感染在耳鼻喉頭頸外科疾病中極為常見,Pae作為耳道感染中分離率最高的革蘭陰性致病菌，近年來受到廣泛關(guān)注。在其耐藥機(jī)制中，生物膜的形成是其逃逸藥物作用的常見方式[8]。有學(xué)者認(rèn)為，形成生物膜可能是耳道感染反復(fù)發(fā)作、久治不愈的原因之一[1，11]。因此，對引起耳道感染的Pae相關(guān)特征進(jìn)行研究,對了解疾病的發(fā)生、發(fā)展及優(yōu)化臨床治療方案都有很深遠(yuǎn)的意義。

解放軍總醫(yī)院共收集到引起耳道感染的Pae 106株，患有耳道感染的患者以41～50歲年齡段相對較多，以女性為主。Pae引起耳道感染的病例復(fù)發(fā)率達(dá)60.38%。在復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組菌株比較中發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)病例分離菌株的產(chǎn)生物膜情況略高于未復(fù)發(fā)病例分離菌株，另外復(fù)發(fā)病例分離菌株對臨床常用的抗菌藥物(頭孢他啶、亞胺培南、美羅培南、左氧氟沙星、哌拉西林、氨曲南和頭孢哌酮/舒巴坦等)敏感率略高于未復(fù)發(fā)病例分離菌株，可見中耳炎的復(fù)發(fā)與Pae的產(chǎn)生物膜情況及敏感率雖沒有直接關(guān)系，但菌株的生物膜產(chǎn)生在其中發(fā)揮著一定的作用，中耳炎的復(fù)發(fā)可能受多個因素的共同影響[12]，這也是筆者下一步將要研究的內(nèi)容。

分離的Pae菌株具有形成生物膜的能力高達(dá)80.20%，其生物膜形成能力以1級和2級為主，與相關(guān)報道基本一致[13]。引起耳道感染的Pae對常見抗菌藥物的敏感率均在50.00%以上(除氨曲南47.17%外)，不同生物膜形成能力的Pae對臨床常見抗菌藥物體外敏感率雖然沒有明顯差異，但是在亞胺培南、頭孢他啶和左氧氟沙星3種抗菌藥物上，產(chǎn)生物膜菌株的敏感率比未產(chǎn)膜菌株敏感率略高，可見是否產(chǎn)生物膜對細(xì)菌的耐藥性影響不大，與文獻(xiàn)報道的略有差異[1]?？赡茉驗椋?1)Pae耐藥機(jī)制較復(fù)雜，且易發(fā)生多重耐藥[14]；(2)Pae生物膜產(chǎn)生過程較為復(fù)雜，受細(xì)菌生長的微環(huán)境、群體感應(yīng)系統(tǒng)及與表型相關(guān)的基因調(diào)控[15]。

在生物膜形成的影響因素研究中，本文發(fā)現(xiàn)葡萄糖和殼聚糖季銨鹽對Pae生物膜的形成分別有一定促進(jìn)和抑制作用，這與相關(guān)文獻(xiàn)基本一致[13,16-17]。國內(nèi)外一些學(xué)者報道，糖尿病是醫(yī)院內(nèi)泛耐藥Pae感染的獨立危險因素[18]，這可能與高血糖等代謝紊亂可使中性粒細(xì)胞功能下降及表面黏附因子增加，有助于微生物聚集形成生物膜有關(guān)。在本研究和相關(guān)文獻(xiàn)中可以看出，葡萄糖對生物膜的形成有促進(jìn)作用[16]，且水平越高促進(jìn)作用越強(qiáng)[13]；殼聚糖季銨鹽對Pae生物膜的形成有一定抑制作用，這與相關(guān)報道基本一致[17]。因此，控制血糖或使用殼聚糖季銨鹽凝膠對生物膜的抑制將起到一定效果。

4 結(jié) 論

引起耳道感染的Pae生物膜形成能力較強(qiáng)，控制血糖水平在正常范圍及使用殼聚糖季銨鹽凝膠對抑制生物膜形成有一定的作用，這對于預(yù)防疾病復(fù)發(fā)有一定的作用。