楊博鴻 田聰陽 張志清 柴欣樓

（北京中醫(yī)藥大學，北京 100029）

膝骨性關節(jié)炎（KOA）是一種以疼痛及關節(jié)活動障礙為主要癥狀的疾病，是膝關節(jié)軟骨和滑膜、肌肉、軟骨下骨、皮質(zhì)骨等膝關節(jié)軟骨周圍組織相互作用的結(jié)果[1]。由于關節(jié)軟骨細胞是一種靜止細胞，在一般情況下不會自我增殖、修復，因此臨床治療較為困難。目前，對于輕中度的KOA患者，以緩解疼痛、緩解軟骨損傷、改善患者生活質(zhì)量為主要治療原則。中醫(yī)學認為本病是由正氣不足、肝腎虧損所致。本課題組自擬方活血壯骨湯由懷牛膝、川芎、當歸、杜仲、桑寄生、狗脊組成，其中牛膝通而能補，性善下行，川芎活血行氣止痛，當歸補血活血止痛，杜仲、狗脊、桑寄生補肝腎強腰脊，諸藥配伍具有補腎強骨、活血通絡止痛的功效。本實驗以木瓜蛋白酶誘導大鼠KOA模型為研究對象，研究活血壯骨湯的治療作用并初步探討其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量250 g，由北京斯貝福公司提供，動物合格證號SCXK（京）2016-0002。

1.2 試藥與儀器

活血壯骨湯，組方：懷牛膝15 g，川芎10 g，當歸12 g，杜仲11 g，狗脊15 g，桑寄生10 g。由北京同仁堂公司提供，北京中醫(yī)藥大學附屬東直門醫(yī)院制劑室制備，加工為含生藥1 g/mL的湯劑。木瓜蛋白酶（BIOR-uler公司）；L-半胱氨酸（Abfans公司），鹽酸氨基葡萄糖膠囊（北京康必得藥業(yè)有限公司，國藥準字H20170173）；酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（天津安諾瑞康有限公司）；BP211D分析天平（德國賽多利斯有限公司）；BS系類電子天平（上海友聲衡器有限公司）；游標卡尺（上海恒勝工具有限公司）；YLS-7C足趾容積儀（廣州市飛迪生物有限公司）；ELX800酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）。

1.3 分組與造模

40只大鼠隨機分為5組，分別為空白組、模型組、活血壯骨湯低劑量組、活血壯骨湯高劑量組、陽性對照組，每組各8只?？瞻捉M不做任何處理，其他組用2%的木瓜蛋白酶溶液與0.03 mol/L的L-半胱氨酸溶液，按照2∶1的比例混合，將大鼠膝關節(jié)屈曲45°，以髕骨下極白色髕腱外緣的膝眼為進針點，向髁間窩方向穿刺進針，抵達股骨髁后回撤2 mm，每周注射2次，每次每個膝關節(jié)腔0.15 mL，連續(xù)4周。

1.4 給藥方法

造模完成后開始灌胃給藥，活血壯骨湯低劑量組予活血壯骨湯75 mg/（kg·d），活血壯骨湯高劑量組予活血壯骨湯300 mg/（kg·d），陽性對照組給予鹽酸氨基葡萄糖藥液157.5 mg/（kg·d），模型組、空白組給予等量的0.9%氯化鈉注射液，每日1次，連續(xù)給藥4周。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 大鼠一般狀況觀察 于造模結(jié)束后和給藥4周后，觀察大鼠體征的變化，包括毛發(fā)、精神狀況、活動情況等。

1.5.2 大鼠膝關節(jié)直徑及足趾容積測量 于造模結(jié)束后和給藥4周后，用游標卡尺對大鼠的膝關節(jié)直徑進行測量集，對兩個時期的關節(jié)直徑進行比較；用足趾容積儀對大鼠的足趾容積進行測量集，對兩個時期的足趾容積進行比較。

1.5.3 血清細胞因子的檢測 連續(xù)給藥4周后，大鼠腹腔注射10%的水合氯醛麻醉，采用腹主動脈取血的方法采集血樣，3 000 r/min離心30 min，取100 μL上清液，用ELISA試劑盒測定血清白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量。

1.5.4 大鼠關節(jié)軟骨組織病理學觀察 采血后處死大鼠，取雙側(cè)膝關節(jié)，充分剝離皮膚肌肉之后置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，10%稀鹽酸脫鈣2～4 d，梯度脫水后石蠟包埋，行額狀面切片（沿膝關節(jié)矢狀面將脛骨內(nèi)側(cè)平臺軟骨下松質(zhì)骨和股骨內(nèi)側(cè)髁軟骨下松質(zhì)骨沿下肢縱軸方向切片，厚度約5 μm），行染色，常規(guī)脫水、透明、封片處理。鏡下用國際骨關節(jié)炎研究學會（OARSI）評分標準[2]對軟骨組織病理學進行分級評分，所得評分越高，說明關節(jié)炎病變程度越高。

1.6 統(tǒng)計學處理

應用SAS8.2統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般狀況觀察

造模結(jié)束后，空白組的大鼠毛發(fā)整齊光滑，情緒不易激怒，納食正常，活動未受限；模型組大鼠皮毛雜亂無章、無光澤，情緒急躁易怒，活動減少。給藥4周后，活血壯骨湯低劑量組較空白組活動較少，下肢運動受限，易激怒程度較高，活血壯骨湯高劑量組以及陽性對照組皮毛有光澤，下肢運動輕微受限，情緒不易激怒。

2.2 各組大鼠膝關節(jié)直徑比較

見表1。造模完成后，與空白組比較，模型組大鼠膝關節(jié)直徑明顯增大（P＜0.05）。給藥4周后，與模型組比較，各用藥組大鼠膝關節(jié)直徑值均降低（P＜0.05）；陽性對照組與活血壯骨湯高劑量組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；活血壯骨湯低劑量組與陽性對照組以及活血壯骨湯高劑量組之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠膝關節(jié)直徑比較（mm，±s）

表1 各組大鼠膝關節(jié)直徑比較（mm，±s）

與空白組比較，?P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05；與陽性對照組比較，#P＜0.05。下同

組別空白組模型組活血壯骨湯低劑量組活血壯骨湯高劑量組陽性對照組n 8 8 8 8 8造模4周后7.165±0.097 8.050±0.092*8.103±0.110*8.118±0.114*8.126±0.128*給藥4周后7.309±0.090▲#8.163±0.079#8.003±0.108▲#7.905±0.121▲7.873±0.149▲

2.3 各組大鼠足趾容積比較

見表2。造模完成后，與空白組比較，模型組大鼠足趾容積明顯增大（P＜0.01）；給藥4周后，與模型組比較，各用藥組大鼠足趾容積均降低（P＜0.05）；各用藥組之間，陽性對照組與活血壯骨湯高劑量組之間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；活血壯骨湯低劑量組與陽性對照組及活血壯骨湯高劑量組之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠足趾容積比較（mL，±s）

表2 各組大鼠足趾容積比較（mL，±s）

組別空白組模型組活血壯骨湯低劑量組活血壯骨湯高劑量組陽性對照組n 8 8 8 8 8造模4周后1.431±0.028 1.644±0.031*1.641±0.029*1.629±0.020*1.626±0.023*給藥4周后1.438±0.032▲#1.639±0.048#1.541±0.040▲#1.484±0.033▲1.475±0.038▲

2.4 各組大鼠血清炎癥因子水平比較

見表3。給藥4周后，與空白組比較，其余各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量均升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清TNF-α、IL-1β含量均降低（P＜0.05）；與陽性對照組比較，活血壯骨湯高、低劑量組血清TNF-α差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），活血壯骨湯高劑量組血清TNF-α水平顯著低于陽性對照組及活血壯骨湯低劑量組（P＜0.05）。與陽性對照組比較，活血壯骨湯高劑量組血清IL-1β含量差別不大（P＞0.05），活血壯骨湯低劑量組的血清IL-1β含量高于陽性藥組（P＜0.05）。

表3 各組大鼠炎癥因子水平比較（pg/mL，±s）

表3 各組大鼠炎癥因子水平比較（pg/mL，±s）

組別空白組模型組活血壯骨湯低劑量組活血壯骨湯高劑量組陽性對照組n 8 8 8 8 8 TNF-α 24.539±4.241▲#74.188±3.588*#54.621±3.728*▲#40.103±5.815*▲#47.879±5.165*▲IL-1β 17.488±4.292▲#90.29±19.942*#65.355±9.256*▲#53.714±4.027*▲54.056±6.219*▲

2.5 病理切片觀察結(jié)果

2.5.1 大鼠關節(jié)軟骨甲苯胺藍染色切片 見圖1。空白組：甲苯胺藍染色軟骨表面平整光滑，表面無裂縫或者缺損，無骨贅的生成，軟骨細胞形態(tài)正常，排列整齊，關節(jié)軟骨4層結(jié)構清晰可辨，潮線清晰完整，軟骨基質(zhì)染色均勻成藍色。模型組：關節(jié)軟骨表面不平整，有缺損及裂縫，伴有骨贅的生成；關節(jié)軟骨細胞形態(tài)異常，排列紊亂，各個層次不能清晰辨識出，潮線完全缺損，軟骨細胞大量減少，出現(xiàn)大量空軟骨陷窩，關節(jié)軟骨染色不均勻，蛋白聚糖出現(xiàn)丟失?；钛獕压菧蛣┝拷M：關節(jié)軟骨表面相對于模型組較光滑平整，相對于正常組，軟骨細胞形態(tài)較為異常，排列較為紊亂，潮線被破壞，部分部位出現(xiàn)關節(jié)軟骨細胞的缺失，有相對較多的空軟骨陷窩，基質(zhì)染色不均勻，蛋白多糖出現(xiàn)丟失?；钛獕压菧邉┝拷M和陽性對照組：相較于模型組，軟骨表面平整，細胞排列較為整齊，關節(jié)軟骨4層結(jié)構基本清晰可見，潮線大致完整，染色較為均勻，缺損的蛋白多糖有所恢復。

圖1 各組大鼠膝關節(jié)軟骨組織病理切片（甲苯胺藍染色，400倍）

2.5.2 大鼠關節(jié)軟骨MASSON染色切片 見圖2?？瞻捉M：MASSON染色軟骨表面平整光滑，表面無裂縫或者缺損，無骨贅的生成；軟骨細胞形態(tài)正常，排列整齊；關節(jié)軟骨4層結(jié)構清晰可辨，潮線清晰完整，軟骨基質(zhì)染色均勻成藍色。模型組：關節(jié)軟骨表面不平整，有缺損及裂縫，伴有骨贅的生成；關節(jié)軟骨細胞形態(tài)異常，排列紊亂，各個層次不能清晰辨識出，潮線完全缺損，軟骨細胞大量減少，出現(xiàn)大量空軟骨陷窩，關節(jié)軟骨染色不均勻，膠原纖維出現(xiàn)丟失。活血壯骨湯低劑量組：關節(jié)軟骨表面相對于模型組較光滑平整，相對于正常組，軟骨細胞形態(tài)較為異常，排列較為紊亂，潮線被破壞，部分部位出現(xiàn)關節(jié)軟骨細胞的缺失，有相對較多的空軟骨陷窩，基質(zhì)染色不均勻，膠原纖維出現(xiàn)丟失?；钛獕压菧邉┝拷M和陽性對照組：與模型組比較，軟骨表面平整，細胞排列較為整齊，關節(jié)軟骨4層結(jié)構基本清晰可見，潮線大致完整，染色較為均勻，缺損的膠原纖維有所恢復。

圖2 各組大鼠膝關節(jié)軟骨組織病理切片（MASSON染色，200倍）

2.6 大鼠膝關節(jié)軟骨損傷OARSI評分

見表4。與空白組大鼠比較，其余各組大鼠膝關節(jié)軟骨損傷OARSI評分均偏高（P＜0.05）。其中活血壯骨湯高劑量組及陽性對照組的OARSI評分要明顯低于活血壯骨湯低劑量組（P＜0.05）?；钛獕压菧邉┝拷M與陽性對照組的OARSI評分比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表4 各組大鼠關節(jié)軟骨損傷OARSI評分比較（分，±s）

表4 各組大鼠關節(jié)軟骨損傷OARSI評分比較（分，±s）

組別空白組模型組活血壯骨湯低劑量組活血壯骨湯高劑量組陽性對照組n 8 8 8 8 8 OARSI評分0.32±0.41▲#★2.28±0.78*#1.83±0.54*▲#1.05±0.62*▲1.18±0.57*▲

3 討 論

KOA主要病理表現(xiàn)為關節(jié)軟骨的進行性退變，繼發(fā)于炎癥相關的增生和關節(jié)軟骨細胞凋亡，女性的患病概率明顯高于男性。KOA屬中醫(yī)學“骨痹”范疇，其發(fā)病與肝、脾、腎虧損及風、寒、濕、瘀血客于局部密切相關，最終導致局部氣滯血瘀、脈絡痹阻不通而發(fā)病[3]。臨床大樣本研究顯示肝腎虧虛是KOA的基礎證型，瘀血貫穿KOA的始終[4]。由此，可以認為KOA患者主要以肝腎虧損并且伴隨氣滯血瘀最為多見。在此基礎上本課題組自擬活血壯骨湯，其組方原則立足于“不通則痛”與“不榮則痛”，通過其補腎、壯骨、強腰膝以及活血行氣的功效達到治病求本的目的。研究表明，活血壯骨湯方中的杜仲、牛膝等藥有抗炎作用，對骨關節(jié)炎患者起到骨保護作用[5-6]。

目前大鼠KOA模型的制備方法多種多樣，大致以關節(jié)固定、關節(jié)腔注射藥物、關節(jié)內(nèi)手術、關節(jié)外誘導以及自發(fā)動物模型為主[7]。本研究采用的是關節(jié)腔內(nèi)注射木瓜蛋白酶誘導骨關節(jié)炎，此方法操作簡單方便，所用時間短，重復性好，并且與人類的骨關節(jié)炎相似[8]。通過實驗結(jié)果得知，造模完成后的大鼠關節(jié)直徑、足趾容積等與空白組比較差異均有顯著性，提示造模成功。在運用活血壯骨湯干預后，活血壯骨湯高、低劑量組的膝關節(jié)直徑、OARSI評分均低于模型組。結(jié)果證明，活血壯骨湯能減輕KOA大鼠的炎癥反應，修復關節(jié)軟骨損傷，并且與劑量呈正相關性。

普遍認為，KOA主要是由于關節(jié)磨損所導致的，但是越來越多的證據(jù)表明在KOA患者關節(jié)軟骨組織、關節(jié)液以及血漿中具有高度表達的炎癥因子[9-10]。持續(xù)存在的炎癥也是KOA過程中導致關節(jié)軟骨退變的重要驅(qū)動因素，其不僅可以引起關節(jié)軟骨細胞合成和分解代謝失衡，而且還能導致關節(jié)軟骨細胞的凋亡[11]。TNF-α是KOA發(fā)病的關鍵性的炎癥因子之一，能協(xié)同IL-1β的作用，在骨關節(jié)炎的發(fā)生過程中起著決定性的作用[12]。TNF-α可以與IL-6協(xié)同作用，影響關節(jié)軟骨合成蛋白多糖組分、蛋白糖胺聚糖以及Ⅱ型膠原蛋白。TNF-α還能促進關節(jié)軟骨組織分泌基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）、基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13），以及解聚蛋白樣金屬蛋白酶（ADAMTS-4）[13]，這些可以導致關節(jié)軟骨細胞的凋亡以及軟骨祖細胞遷移障礙，這些都剝奪了關節(jié)軟骨再生的可能[14]。TNF-α能降低呼吸鏈的效率，使關節(jié)軟骨細胞產(chǎn)生的ATP減少，線粒體的膜電位降低[15]。IL-1β是KOA發(fā)病的關鍵性的炎癥因子之一，它對關節(jié)軟細胞代謝以及細胞外基質(zhì)有著顯著影響[16]。許多研究證實IL-1β可以阻礙軟骨細胞合成細胞外基質(zhì)，干擾關鍵結(jié)構蛋白的比如蛋白糖胺聚糖以及Ⅱ型膠原蛋白的合成[17]。除開對這些關鍵物質(zhì)合成的阻礙作用外，還能促進基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs的分泌來破壞關節(jié)軟骨成分[18]。實驗結(jié)果顯示，活血壯骨湯高、低劑量組大鼠血清當中的TNF-α、IL-1β含量均比模型組低，提示活血壯骨湯可能通過抑制TNF-α、IL-1β的分泌發(fā)揮抗炎作用，起到改善癥狀的作用。活血壯骨湯可以減輕KOA的疼痛，修復關節(jié)軟骨損傷，抑制炎癥因子的分泌，可以成為KOA治療的潛在方向。