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        電針不同穴位對(duì)腸易激綜合征大鼠精神行為及NMDA受體表達(dá)的影響研究?

        2020-06-15 02:08:34王一凡郭孟瑋吉毛先朱文蓮任曉暄
        中國(guó)中醫(yī)急癥 2020年5期
        關(guān)鍵詞:實(shí)驗(yàn)模型

        覃 穎 王一凡 郭孟瑋 藍(lán) 瑩 王 珊 吉毛先 朱文蓮 任曉暄

        (北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029)

        腸易激綜合征(IBS)是一種典型的身心性疾病,伴有腹痛、腹瀉等腹部癥狀[1]。精神心理障礙是其重要病機(jī)之一[2],與腹部癥狀通過(guò)腦-腸軸[3]相互影響,使“心”和“身”兩方面的病癥不斷加重。因此,在治療IBS時(shí),應(yīng)注重“心”即精神情緒方面的治療,達(dá)到“心身”同調(diào)。

        印堂與大椎穴均能調(diào)神,同屬督脈,但二穴在功能上有所差異,印堂穴偏向于治療不寐虛證、郁證等,而大椎穴偏向于治療小兒驚風(fēng)、癲狂癇證等。既往研究表明,NMDA受體與精神情緒等密切相關(guān)[4]。因此本實(shí)驗(yàn)以IBS模型大鼠為研究對(duì)象,通過(guò)比較電針“印堂”“大椎”二穴對(duì)IBS模型大鼠的腹部回撤反射檢測(cè)(AWR)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(OFT)以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)前扣帶回皮層(ACC)中NMDA受體的陽(yáng)性表達(dá),觀察不同穴位對(duì)IBS情緒異常是否具有療效及其效應(yīng)差異,以此闡釋經(jīng)穴效應(yīng)特異性。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 購(gòu)入清潔級(jí)健康Wistar孕鼠5只,清潔柜飼養(yǎng),室溫維持在(23±2)℃,12 h晝夜交替,自由飲水。

        1.2 試藥與儀器 電子秤(ER-182A型,日本);電針儀(LH-202H型,北京禎怡科技發(fā)展公司);毫針(0.30 mm×13 mm,北京中研太和科技有限公司);BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限責(zé)任公司);雙腔兒科導(dǎo)尿管(BARD-FOLEY,美國(guó));乙酸、液體石蠟(北京化學(xué)試劑公司);10%中性甲醛(北京百諾威生物科技有限公司);2%戊巴比妥鈉(北京歐北科技生物科技有限公司);Tirzol試劑(美國(guó)Invitrogen公司),反轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶、PCR試劑(Promega公司);PCR引物由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成。

        1.3 造模與分組 孕鼠生產(chǎn)后,將幼鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、印堂組和大椎組,每組10只。除空白對(duì)照組外均造模,同等條件飼養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)方案符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)倫理學(xué)規(guī)定。通過(guò)母嬰分離加醋酸灌腸結(jié)合結(jié)直腸擴(kuò)張(CRD)聯(lián)合造模。方法如下:幼鼠出生2~21 d于8∶00~11∶00進(jìn)行3 h的母嬰分離。8~21 d給予0.5%醋酸灌腸,具體灌注量見(jiàn)表1。22~42 d不予任何干預(yù)。6周齡時(shí)給予CRD刺激(將潤(rùn)滑后的6F導(dǎo)尿管經(jīng)大鼠肛門(mén)插入,深度約為7 cm,固定,待大鼠適應(yīng),用0.5 mL/min的速度均勻緩慢地向?qū)蚬苤凶⑺?.5 mL擴(kuò)張結(jié)直腸,維持30 s,以出現(xiàn)腹部抬起為準(zhǔn)。重復(fù)3次,每次間隔5 min),加強(qiáng)模型的穩(wěn)定性。造模至8周齡,普通喂養(yǎng)。

        表1 IBS幼鼠模型制備醋酸灌注量(mL)

        1.4 干預(yù)方法 兩電針組在第9周進(jìn)行電針治療。穴位定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[5]:“印堂”(兩眼中點(diǎn)偏上2 mm處,斜刺2 mm);“大椎”(第7頸椎與第1胸椎間,直刺5 mm)。具體操作如下:固定大鼠,將針具刺入相應(yīng)穴區(qū),并在其旁開(kāi)約1 mm的同一穴區(qū)再刺入1針,兩針不相接觸,以防短路。連接韓氏電針儀,同一對(duì)正負(fù)極連接同名穴區(qū)的兩針柄,疏密波,2/100 Hz,強(qiáng)度以引起大鼠肢體微動(dòng)為度,20 min/次,隔日1次,共5次。

        1.5 檢測(cè)指標(biāo) 1)腹部回撤反射檢測(cè)(AWR):禁食不禁水8 h后進(jìn)行AWR。本實(shí)驗(yàn)參照Al-Chaer[6]的方法予以改良,具體方法:自制球囊,將球囊、微量注射泵、壓力換能器與BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)連接,并檢查保證管路的密封性。固定大鼠:將大鼠放至與微量注射泵同高度的位置,固定并將潤(rùn)滑后的球囊頭端緩慢插入肛門(mén)約8 cm,用膠布帶與鼠尾固定。安撫大鼠等其適應(yīng)后打開(kāi)微量注射泵,以1 mL/min的速度勻速緩慢注水,共1.5 mL,使球囊擴(kuò)張,持續(xù)時(shí)間為90 s。標(biāo)記起始收縮波的潛伏期、收縮波個(gè)數(shù)。同一只大鼠檢測(cè)3次(時(shí)間間隔30 min以上),取其平均值統(tǒng)計(jì)。2)曠場(chǎng)試驗(yàn)(OFT):AWR測(cè)試后的第2天進(jìn)行。適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境約10 min后,打開(kāi)自主行為裝置,將大鼠放入敞箱中央,記錄大鼠在5 min內(nèi)水平和垂直運(yùn)動(dòng)(兩個(gè)前肢同時(shí)豎立記為1次)的次數(shù)。每次測(cè)試后,清理敞箱,不留異物異味。3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)NMDA receptor1(NR1)、NMDA receptor2A(NR2A)、NMDA receptor2B(NR2B)表達(dá)水平。麻醉處死大鼠,取腦組織,檢測(cè)ACC中NMDA表達(dá)。NMDA receptor1:sense:5′-GCTGTACCTGCTGGACCGCT-3′,antisense:5′-GCAG TGTAGGAAGCCACTATGATC-3′,predicted size(bp):219 bp;NMDA receptor2A:sense:5′-TCCATTCTTCTGTCATCC TGC-3′,antisense:5′-AAGACCGTCTCTCACTCTTGC-3′predicted size(bp):225 bp;NMDA receptor2B:sense:TGCACAATTACTCCTCGACG-3′,antisense:5′-TCCGATTCTTCTTCTGAGCC-3′,predicted size(bp):222 bp。

        1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SAS8.2統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以()表示。組間差異采用單因素方差分析,繼以LSD檢驗(yàn);不服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用非參數(shù)檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 各組大鼠AWR實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 見(jiàn)表2。與空白對(duì)照組比較,模型對(duì)照組的潛伏期明顯降低、收縮波個(gè)數(shù)明顯增多(P<0.01);與模型對(duì)照組比較,印堂組的潛伏期明顯上升、收縮波個(gè)數(shù)明顯減少(P<0.01),大椎組的潛伏期上升(P<0.05);與印堂組比較,大椎組收縮波個(gè)數(shù)明顯增多(P<0.01)。

        表2 各組大鼠AWR實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較(±s)

        表2 各組大鼠AWR實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較(±s)

        與空白對(duì)照組比較,△P<0.05,△△P<0.01;與模型對(duì)照組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01;與印堂組比較,◆◆P<0.01。下同

        n組別空白對(duì)照組模型對(duì)照組印堂組大椎組10 10 10 10潛伏期(s)82.83±6.45 51.02±11.07△△69.59±10.04△△▲▲62.25±10.47△△▲收縮波個(gè)數(shù)1.07±0.80 3.23±1.52△△1.33±0.50△△▲▲2.70±0.90△△◆◆

        2.2 各組大鼠OFT結(jié)果比較 見(jiàn)表3。與空白對(duì)照組比較,模型對(duì)照組的水平以及垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)均明顯減少(P<0.01);與模型對(duì)照組比較,印堂組水平以及垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)均明顯增加(P<0.01);與印堂組比較,大椎組的水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)明顯減少(P<0.01)。

        表3 各組大鼠OFT結(jié)果比較(±s)

        表3 各組大鼠OFT結(jié)果比較(±s)

        組別空白對(duì)照組模型對(duì)照組印堂組大椎組n 10 10 10 10 5min水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)1 575.10±255.36 1 050.70±271.56△△1 478.20±277.26▲▲1 126.90±214.48△△◆◆5min垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)151.50±36.03 81.20±36.64△△124.60±42.18▲▲103.20±23.42△△

        2.3 各組大鼠NR1、NR2A、NR2B的表達(dá)比較 見(jiàn)表4。與空白對(duì)照組比較,模型對(duì)照組的NR1、NR2A、NR2B表達(dá)均增多(P<0.05);與模型對(duì)照組比較,印堂組的NR1、NR2A、NR2B表達(dá)均顯著減少(P<0.05),大椎組的NR1、NR2B表達(dá)均顯著減少(P<0.05),印堂組NR2A表達(dá)低于大椎組。

        表4 各組大鼠NR1、NR2A、NR2B的表達(dá)比較(ΔΔCt,±s)

        表4 各組大鼠NR1、NR2A、NR2B的表達(dá)比較(ΔΔCt,±s)

        組別空白對(duì)照組模型對(duì)照組印堂組大椎組n 6 6 6 6 NR1 0.49±0.17 0.92±0.36△0.59±0.14▲0.53±0.37▲NR2A 0.40±0.14 0.73±0.19△0.40±0.27▲0.54±0.33 NR2B 0.49±0.17 0.92±0.36△0.59±0.14▲0.53±0.37▲

        3 討 論

        NMDA受體[7](NMDAR)是一種配體門(mén)控離子型谷氨酸受體,參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)許多重要的生理病理過(guò)程,是治療某些神經(jīng)精神性疾病的靶點(diǎn)。NR1是NMDA受體復(fù)合物的必需功能亞單位,NR2是NMDA受體活性的調(diào)節(jié)亞單位,因此高活性的NMDA受體通道必須由一個(gè)NR1以及一個(gè)或幾個(gè)NR2亞型共同構(gòu)成異寡聚體所形成[8]。NR2A和NR2B大量分布于與疼痛傳導(dǎo)密切相關(guān)的ACC中[9],因此ACC中NMDA受體的激活(尤其是NR2A和NR2B)對(duì)疼痛情緒的產(chǎn)生發(fā)揮了重要的作用[10]。黃俊景[11]發(fā)現(xiàn) ACC 內(nèi)的NR2A和NR2B在炎癥后表達(dá)上調(diào),增強(qiáng)了ACC神經(jīng)元的興奮性,這可能是導(dǎo)致疼痛情緒形成的重要原因。本實(shí)驗(yàn)中,IBS模型大鼠NMDA受體在ACC中的表達(dá)增高,與以往實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

        針灸對(duì)于情緒方面的疾病有獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)。督脈“上入絡(luò)腦”,治療上常取督脈的穴位用以調(diào)神。印堂穴為經(jīng)外奇穴,為兩邊目系交匯,與多條陰經(jīng)聯(lián)系,如足厥陰肝經(jīng)、手少陰心經(jīng)等,心、肝二陰經(jīng)在治療情志病中有著重要作用。筆者認(rèn)為印堂穴所灌注的氣血中,更多的是肝、心等陰經(jīng)的氣血,這也是古人歷經(jīng)千年并沒(méi)有將其列為督脈穴位的原因。臨床研究[12-13]發(fā)現(xiàn)印堂穴能有效改善焦慮抑郁等精神異常類的慢性疾病,且對(duì)提高IBS的排便滿意度效果良好。大椎穴是手足三陽(yáng)與督脈的交會(huì)穴,其六陽(yáng)之氣充盛,針刺大椎可加強(qiáng)元神之府對(duì)全身臟腑機(jī)能的調(diào)整作用,有除陽(yáng)經(jīng)邪熱、定志安神之功。臨床研究[14-15]發(fā)現(xiàn)大椎穴多用來(lái)治療熱擾神明所致的失眠、中風(fēng)后抑郁、癲癇等急性精神類疾病,治療單純性抑郁癥的研究少見(jiàn)。

        中醫(yī)認(rèn)為,肝郁脾虛[16]是IBS主要發(fā)病因素。從其病機(jī)來(lái)看,印堂穴對(duì)IBS情緒方面的療效應(yīng)優(yōu)于大椎。本實(shí)驗(yàn)造模周期長(zhǎng),與IBS的發(fā)病特征一致,大鼠出現(xiàn)精神淡漠等抑郁樣情緒。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明電針“印堂”“大椎”穴后均能調(diào)節(jié)IBS大鼠抑郁樣精神行為,且印堂組優(yōu)于大椎組,與中醫(yī)理論基本相符。

        綜上所述,“印堂”和“大椎”穴均可改善IBS模型大鼠的抑郁樣行為,但兩者存在效應(yīng)差異,即“印堂”穴的作用明顯優(yōu)于“大椎”穴。說(shuō)明相同經(jīng)脈且有相近主治功能的穴位亦具有經(jīng)穴效應(yīng)特異性。在本實(shí)驗(yàn)中,“印堂”和“大椎”穴也可緩解腹痛,降低腸道高敏感性,這也體現(xiàn)了中醫(yī)的整體觀,但二穴之間差異的確切機(jī)制尚有待進(jìn)一步深入研究。

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