關健斌 仇永鋒 楊利學 梁浩浩

(陜西中醫(yī)藥大學2016級碩士研究生，陜西 咸陽 712046)

斷肢再植術是在顯微鏡下將離斷后的肢體進行斷端重建，其中包括骨骼、肌腱、血管、神經等組織對接重建，再通斷肢的血液供應，以期最大程度恢復殘肢生理功能的一類高難度精細手術。雖然隨著醫(yī)學的進步，手術成功率逐漸提高，但一但失敗則會出現(xiàn)不可逆轉的情況。其中血管危象是斷肢再植術失敗的主要原因[1]，主要是指顯微外科手術中對細小動靜脈吻合后，由于吻合口痙攣或血栓栓塞，進而血運受阻，器官組織血液灌注量不足，甚至出現(xiàn)壞死[2]。因此，處理血管危象的關鍵是避免吻合端血栓形成，減輕炎性反應，抑制體內的抗凝機制。

肝素及罌粟堿等在顯微外科手術中的廣泛應用，使得血管危象的發(fā)生率逐年降低，但也存在不可避免的副作用[3]。隨著對水蛭的不斷研究，發(fā)現(xiàn)其所含的水蛭素屬于一種自然的凝血酶抑制劑，是由65個氨基酸殘基組成的一條多肽類物質[4-5]。水蛭素可與機體內凝血酶的受體在不借助輔助因子的條件下特異性結合，產生抗凝作用，預防血管吻合端血栓的形成，促進再植術后遠端血流的恢復，從而提高遠端肢體組織的有效灌注量。有研究發(fā)現(xiàn)，天然水蛭素可促進肉芽組織生成，抑制炎癥細胞對受損組織的浸潤[6-7]。本實驗通過觀察局部外用水蛭素對斷肢再植時吻合端血管通暢率、血栓形成及炎癥細胞浸潤程度、遠端肢體血流灌注及機體凝血功能的影響，以期尋找一種能提高再植肢體成活率的新型無副作用中藥提取物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康新西蘭白兔48只，雌雄不限，體質量(3.0±0.5) kg，購于西安易諾谷生物科技有限公司，動物合格證號：SCXK(陜)2018-0001，于陜西中醫(yī)藥大學中藥協(xié)同創(chuàng)新中心實驗動物房統(tǒng)一飼養(yǎng)，溫度23～25 ℃，濕度50%～70%，飼料由西安交通大學醫(yī)學實驗動物中心提供。

1.1.2 實驗試劑 天然水蛭素凍干粉(南寧凈雪皇生物工程有限公司)；肝素鈉注射液(常州千紅生化制藥股份有限公司，國藥準字H32022088)；活化部分凝血活酶時間(APTT)測定試劑盒[天津美德太平洋科技有限公司，津食藥監(jiān)械(準字2010第2400022號)]；纖維蛋白原(FIB)測定試劑盒[上海長島生物技術有限公司，滬食藥監(jiān)械(準)字2013第2401010號]；0.9%氯化鈉注射液(安徽雙鶴藥業(yè)有限責任公司，國藥準字H34023607)；碘伏消毒液[山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司，魯衛(wèi)消證字(2002)第0059號]；10%水合氯醛溶液(上海山浦化工有限公司)；10%甲醛溶液(上海哈靈生物科技有限公司)；注射用頭孢呋辛鈉(國藥集團威奇達藥業(yè)有限公司，國藥準字H20066954)；蘇木素染液(珠海貝索生物技術有限公司)。

1.1.3 實驗儀器 經濟型連續(xù)變倍體視顯微鏡(SZM-7045型，無錫鑫能達科技有限公司)；顯微鏡(BX50型，日本OLYMPUS公司)；高速臺式離心機(TGL-20B型，上海安亭科學儀器廠)；激光多普勒血流儀(PeriFlux5010型，瑞典Perimed AB公司)；全自動血凝分析儀(C2000-A型，北京普利生儀器有限公司)；電子秤(永康市珠恒電子有限公司)；長毛兔電推剪(T82型，荷蘭皇家飛利浦公司)；石蠟切片機(日本SONY公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將48只新西蘭白兔按照隨機數(shù)字表法分為3組，對照組、肝素鈉注射液組、水蛭素組，每組16只。

1.2.2 模型制備及給藥 分別對新西蘭白兔稱質量，使用20 mL無菌醫(yī)用注射器抽取10%水合氯醛溶液，以4.5 mL/kg體質量腹腔注射進行麻醉，之后每小時0.5 mL/kg體質量進行麻醉維持。待兔無抵抗力、角膜反射減弱直到消失時，將兔仰臥位展開，置于操作臺上，備皮區(qū)域需稍大于手術區(qū)域，用長毛兔電推剪將兔左側后肢及部分腹部毛發(fā)推剪干凈。備皮完成后用碘伏對手術野進行消毒，采用激光多普勒血流儀探測兔股動脈走行，并用記號筆沿所探測的動脈走行各畫1條長約4 cm的縱行手術切口標記(于腹股溝中點切至股骨中下段)。打開無菌手術器械包、顯微手術器械包，穿戴無菌手套、無菌手術衣，手術區(qū)域進行常規(guī)消毒及鋪巾，實驗過程完全遵守無菌原則。根據(jù)之前的手術畫線，使用無菌手術刀切開皮膚、淺筋膜直至皮下深筋膜層，用彎鉗鈍性分離肌肉組織，暴露股動脈鞘，然后分離股動脈、股靜脈及股神經。由于10%水合氯醛溶液對周圍神經的麻醉效果較差，因此分離出股神經后，將股神經切斷，防止術中疼痛引起兔體位改變，甚至休克，導致實驗進行困難或失敗。用2個顯微外科動脈夾夾住股動脈近心端和遠心端，阻斷股動脈血運，從中間橫行切斷股動脈(動脈切斷點統(tǒng)一為髂外動脈分叉下端1 cm處)，然后檢查兩斷端是否整齊，并修剪血管外膜。對照組用0.9%氯化鈉注射液，肝素鈉注射液組用肝素鈉注射液62.5 U/mL，水蛭素組用天然水蛭素凍干粉液(5 mg天然水蛭素凍干粉∶100 mL 0.9%氯化鈉注射液)，各150 mL，由兩血管斷端沖洗血管腔。然后用10-0尼龍線行原位斷端吻合術，保證進針時針尖與血管管壁角度垂直，內膜良好對合前進行縫合，并在吻合口最后一針未打結前，在吻合端處注入相應溶液。完全吻合后，再在吻合端局部分別注射上述對應3組液體各2 mL，觀察血管通暢情況，確保再植術模型造模成功，然后用5-0尼龍線逐層縫合傷口。手術完成后，予注射用頭孢呋辛鈉兔臀大肌注射防止感染。為避免兔之間相互撕咬導致吻合端斷裂或傷亡，術后每只兔進行單獨分籠飼養(yǎng)。

1.3 觀察指標

1.3.1 大體觀察 每組術后即刻取16只兔，術后24 h取其中8只兔，術后48 h取余下8只兔，使用20 mL無菌醫(yī)用注射器抽取10%水合氯醛溶液4.5 mL/kg進行腹腔注射麻醉，待兔角膜反射消失后，打開手術切口，顯露吻合端，在顯微鏡下觀察血管管腔的再通情況、周圍組織粘連程度、吻合端水腫情況等，再進行血管通暢實驗，即用2個顯微外科動脈夾夾住股動脈血管斷端兩側，將動脈夾所夾血管間的血液排空，然后松開近心端的動脈夾，觀察動脈血管是否充盈。

1.3.2 經皮激光多普勒血液灌注檢測 采用激光多普勒血流儀的血液灌注監(jiān)測系統(tǒng)(LDPM)模塊[8]對組織內血流灌注量及移動紅細胞密度(CMBC)平均值進行量化，其值表示的是灌注單位(PU)。術前將激光多普勒血流儀的Small Straight Probe404探頭接觸每只兔左側后肢最末端，測定兔左側后肢末端血運，并用標記筆在探測點標記，術后24 h、48 h均在此處測定兔左側后肢末端血運。探測過程中探頭觸碰組織的同時應保持接觸面無壓力，并用儀器匹配的雙面膠布將探頭固定在測定點。探頭另一側連接計算機，通過自帶軟件得出相關PU值。

1.3.3 病理組織學觀察 術后24 h、48 h進行大體觀察和肢體末端血運測定后，將血管吻合處的血管段切除(長1 cm左右)，用10%甲醛溶液固定24 h，然后進行組織脫水，將切除的血管段取出，于70%、80%、90%、100%乙醇梯度浸泡，每種濃度浸泡30 min，最后再次浸泡于100%乙醇中30 min。然后進行透明，將所取血管段依次浸泡于二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各30 min。經上述步驟后，進行石蠟浸蠟與包埋，待石蠟凝固后，將蠟塊取出，對蠟塊進行修正并做標記存放。將石蠟包埋好的血管段固定于切片機上，連續(xù)切成4 μm厚度薄片，將切下的血管薄片放于溫水中，然后將其輕輕貼附于防脫載玻片上，再將組織切片進行烤片。接著進行蘇木素-伊紅(HE)染色，具體染色方法如下：將切片進行脫蠟和水化，然后應用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，每次3 min，然后置于蒸餾水中待用。將脫蠟和水化后的組織標本完全浸沒蘇木素染液中5 min，然后取出用流水沖洗掉切片上的蘇木素染液，再完全浸于1%鹽酸乙醇溶液中分化脫色，流水再次沖洗切片，然后將切片浸泡入溫水中返藍10 min，再用流水沖洗。將以上切片完全浸于0.5%伊紅染色，進行乙醇梯度脫水(同上)，然后進行透明處理，浸入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各1 min。最后進行切片的風干和封片。在顯微鏡下放大200倍觀察組織細胞并進行拍照，觀察染色后吻合端周圍炎癥細胞浸潤與組織壞死程度。然后用Image Pro Plus 6.0醫(yī)學圖像處理系統(tǒng)測量血栓占比。

1.3.4 凝血功能檢測 術前及術后24 h、48 h，采集每只兔耳緣靜脈血1.8 mL，加入枸櫞酸鈉抗凝劑0.2 mL，進行震蕩混合，充分混勻后，用離心機3 000 r/min，離心10 min。采用全自動血凝分析儀檢測凝血功能指標APTT和FIB。

2 結 果

2.1 3組兔大體觀察 術后即刻，3組兔血管斷端處輕度滲血但無血凝塊附著于管壁，與周圍組織間無任何粘連，吻合端處輕度腫脹，血管呈淡紅色，血管通暢實驗均為陰性，血管吻合術后通暢率為100%。術后24 h，對照組兔血管斷端吻合處血管外壁稍有隆起，部分可見血管斷端吻合處有血凝塊形成，近端較遠端管腔大，血液流速慢，血管通暢實驗為弱陽性。肝素鈉注射液組、水蛭素組兔血管斷端吻合處血管平滑，無血凝塊黏附，血管通暢實驗均為陰性。術后48 h，對照組兔血管與周圍組織稍有粘連，很難進行游離。血管斷端吻合處縫合線部分顯露，未再通而栓塞，血管內看到血凝塊于血管內壁附著，吻合端遠端無血流，血管通暢實驗為陽性，管腔由于缺乏血液提供營養(yǎng)而變干。肝素鈉注射液組、水蛭素組兔血管斷端吻合處平滑，無血凝塊黏附，血管與周圍組織均無粘連，血管壁較術后24 h彈性下降，血管通暢實驗為陰性。

2.2 3組兔術后即刻及術后24 h、48 h股動脈血管通暢率比較 見表1。

表1 3組兔術后即刻及術后24 h、48 h股動脈血管通暢率比較 %

與對照組比較，*P<0.05；與肝素鈉注射液組比較，△P<0.05

由表1可見，術后即刻，3組兔股動脈血管通暢率比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。術后24 h、48 h，肝素鈉注射液組、水蛭素組兔股動脈血管通暢率均高于對照組同期(P<0.05)。術后48 h，水蛭素組兔股動脈血管通暢率高于肝素鈉注射液組同期(P<0.05)。

2.3 3組兔術后24 h、48 h平均PU值、血栓占比比較 見表2。

對照組術后24 h(n=8)術后48 h(n=8)肝素鈉注射液組術后24 h(n=8)術后48 h(n=8)水蛭素組術后24 h(n=8)術后48 h(n=8)PU值2.20±0.401.20±0.50#4.10±1.50?4.30±1.70△4.30±1.40?4.40±1.40△血栓占比8.12±1.5311.25±2.935.36±1.35?7.36±2.15△5.23±1.12?7.23±1.98△

與對照組術后24 h比較，*P<0.05；與對照組術后48 h比較，△P<0.05；與本組術后24 h比較，#P<0.05

由表2可見，術后24 h、48 h，肝素鈉注射液組、水蛭素組平均PU值均高于對照組同期(P<0.05)，血栓占比均低于對照組同期(P<0.05)；肝素鈉注射液組與水蛭素組平均PU值、血栓占比比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。對照組術后48 h平均PU值低于本組術后24 h(P<0.05)。

2.4 3組兔術前、術后24 h、術后48 h APTT、FIB比較 見表3。

由表3可見，術后24 h、48 h，肝素鈉注射液組、水蛭素組APTT均高于對照組(P<0.05)，F(xiàn)IB均低于對照組(P<0.05)；肝素鈉注射液組與水蛭素組APTT、FIB比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

對照組術前(n=16)術后24 h(n=8)術后48 h(n=8)肝素鈉注射液組術前(n=16)術后24 h(n=8)術后48 h(n=8)水蛭素組術前(n=16)術后24 h(n=8)術后48 h(n=8)APTT(s)24.21±2.8911.28±1.269.23±0.9523.98±3.2928.52±4.33?33.82±8.01△23.62±3.1929.12±4.67?34.21±7.86△FIB(g/L)2.62±0.604.52±0.536.35±1.542.55±0.743.52±0.82?3.35±0.84△2.46±0.793.43±0.71?3.45±0.87△

與對照組術后24 h比較，*P<0.05；與對照組術后48 h比較，△P<0.05

2.5 3組兔術后24 h、48 h組織病理學觀察 術后24 h，與對照組比較，肝素鈉注射液組和水蛭素組均可見新生薄壁血管生成，其中水蛭素組最多。3組均可見大量炎癥細胞浸潤，其中對照組炎癥細胞浸潤最重，水蛭素組炎癥細胞浸潤情況最輕。術后48 h，與對照組比較，肝素鈉注射液組和水蛭素組均可見較多的新生薄壁血管形成；對照組炎癥細胞浸潤明顯增加，部分細胞內皮細胞出現(xiàn)凋亡、壞死，而肝素鈉注射液組和水蛭素組炎癥細胞浸潤明顯較術后24 h減少，炎性反應較對照組輕。見封3，圖1。

3 討 論

斷肢再植術后血管危象的成因主要有血管平滑肌收縮導致的血管痙攣。由于傷后情緒刺激導致血管緊張素增多[9]，同時交感神經興奮，其末梢釋放大量去甲腎上腺素等化學遞質，引起全身大小動靜脈處于持續(xù)緊張狀態(tài)，造成肢體遠端血流灌注不足，甚至血運消失[10]。另外，疼痛刺激促使受損組織細胞釋放多重內源性致痛物質，刺激全身動靜脈引起血管收縮，導致痙攣[11]。血管內膜損傷是另一大主要因素，血管內膜損傷后，其抗凝血系統(tǒng)平衡被打破，促使內膜分泌大量的血栓素B2(TXB2)、內皮素，以及降低血管內皮生長因子(VEGF)的表達，造成血管吻合處血栓堆積，從而導致再植術后遠端肢體血運障礙。肝素鈉主要通過與抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)結合，而增強后者對活化的凝血因子Ⅱ、Ⅸ、X、Ⅺ和Ⅻ的抑制作用，從而阻止血小板凝集，阻止凝血酶原變?yōu)槟?，抑制纖維蛋白原變成纖維蛋白，發(fā)揮體內和體外抗凝作用。已有研究證實，局部應用天然水蛭素能降低TXB2、血管內皮素(ET)含量，減少血栓形成，提高VEGF的表達，促進新生薄壁毛細血管形成[12]。由于損傷，損傷部位和周圍組織會合成并釋放大量凝血酶、炎癥因子，從而激活凝血系統(tǒng)和炎性反應，產生一系列病理變化，抑制吻合端修復[13]。天然水蛭素通過抑制凝血酶的相關信號通路，減少血栓形成，調節(jié)VEGF與血管生成拮抗因子之間的動態(tài)平衡，抑制炎性反應，最終對斷肢再植術后的血管危象達到預防作用[14-15]。

本實驗中通過LDPM模塊對組織內血流灌注量及CMBC平均值進行量化，即PU值進行比較。結果顯示，術后24 h，肝素鈉注射液組、水蛭素組PU值均高于對照組(P<0.05)。術后48 h，肝素鈉注射液組、水蛭素組PU值穩(wěn)定于術后24 h水平，而對照組有下降趨勢(P<0.05)。通過大體觀察股動脈血管通暢率，肝素鈉注射液組和水蛭素組術后24 h、48 h均高于對照組(P<0.05)，且術后48 h水蛭素組高于肝素鈉注射液組(P<0.05)。說明天然水蛭素可以更長期發(fā)揮與肝素鈉注射液相同的作用，提高吻合血管術后血管通暢率，有效預防肢體末端血運障礙。

通過HE染色觀察切片中各炎癥細胞的浸潤情況，顯示對照組術后24 h、48 h炎癥細胞浸潤高于肝素鈉注射液組和水蛭素組；對照組血管吻合端血栓占比高于肝素鈉注射液組和水蛭素組同期(P<0.05)。凝血功能監(jiān)測結果表明，術后24 h、48 h對照組APTT均低于肝素鈉注射液組和水蛭素組同期(P<0.05)，F(xiàn)IB均高于肝素鈉注射液組和水蛭素組同期(P<0.05)；而肝素鈉注射液組和水蛭素組趨于正常值，比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。說明水蛭素能通過抑制體內凝血機制和降低炎性反應來抑制血栓形成。

綜上所述，天然水蛭素具有良好的抑制血管吻合端血栓形成、降低炎性反應的作用。通過HE染色觀察，在抑制炎性反應的效果上，優(yōu)于肝素鈉注射液組；在預防血栓形成、抑制凝血系統(tǒng)、恢復肢體遠端血運的作用上與肝素鈉注射液組相似。說明天然水蛭素既有預防吻合端血栓形成、抑制凝血系統(tǒng)、恢復肢體遠端血運的作用，又能抑制炎性反應造成的應激。