姜 瑾 任 平 王 瑩 劉 悅 許 杰 李國信

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院學(xué)科學(xué)位辦公室，遼寧 沈陽 110034)

偏頭痛又稱血管神經(jīng)性頭痛，是一種以頭痛暴作、疼痛劇烈、或左或右、反復(fù)發(fā)作為特征的常見病、多發(fā)病[1]。某些易感個體服用硝苯地平片、硝酸異山梨酯片或硝酸甘油片后可出現(xiàn)典型的偏頭痛發(fā)作[2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療以終止頭痛發(fā)作、緩解伴發(fā)癥狀和預(yù)防復(fù)發(fā)為原則。但西藥治療副作用大，易形成藥物依賴，甚至發(fā)展為藥物依賴性頭痛或慢性偏頭痛，目前尚缺乏理想的治療手段[3]。中醫(yī)藥治療偏頭痛積累了數(shù)千年的經(jīng)驗，中醫(yī)藥典籍中記載的有效方藥較多[4]。偏治顆粒是由《醫(yī)學(xué)集成》中偏治湯加減而成，主要藥物為白芍、白術(shù)、當(dāng)歸、茯苓、柴胡、半夏、芥子，主治偏頭痛、吐沫流涎等。本實驗通過觀察偏治顆粒對硝酸甘油誘導(dǎo)偏頭痛大鼠模型的影響，以期探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雌性SD大鼠60只，8周齡，體質(zhì)量180～220 g，由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供，動物合格證號：SCXK(遼)2015-0001。飼養(yǎng)于遼寧省中醫(yī)藥研究院動物實驗室，實驗動物屏障系統(tǒng)內(nèi)溫度為22～25 ℃，濕度為55%～60%，大鼠自由飲水，晝夜循環(huán)光照。

1.1.2 實驗藥物及試劑 偏治顆粒(藥物組成：白芍6 g，焦白術(shù)6 g，當(dāng)歸2 g，茯苓2 g，柴胡2 g，半夏6 g，芥子3 g，甘草3 g)，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院提供(批號：20161123)，5 g/袋，每袋相當(dāng)于生藥30 g。琥珀酸舒馬普坦片(天津華津制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20040700)，100 mg/片。無水乙醇(沈陽市新化試劑廠)；磷酸鹽緩沖液(PBS，北京索萊寶科技有限公司)；大鼠降鈣素基因相關(guān)肽1型(CGRP-1)免疫組化試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；大鼠P物質(zhì)免疫組化試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；多聚甲醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；DAB顯色試劑盒、檸檬酸鹽緩沖液(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)；10%水合氯醛溶液(北京市旭東化工廠)；二甲苯(沈陽市新化試劑廠)；TMS-P超敏試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，包含生物素標(biāo)記的二抗(兔抗鼠)、內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑和鏈霉親和素-過氧化物酶；蘇木素染液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)。

1.1.3 主要儀器 光學(xué)顯微鏡[BX53型，奧林巴斯(中國)有限公司]；電熱恒溫培養(yǎng)箱(JKDP-2型，廈門醫(yī)療電子儀器廠)；烤片機(YG-280KX型，湖北孝感市陽光神琦醫(yī)用科技有限公司)；全自動脫水機(TP1020型，德國徠卡公司)；冰凍切片機(CM1950型，德國徠卡公司)；攤片機(YG-280KX型，湖北孝感市陽光神琦醫(yī)用科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組[5]將60只SD大鼠按照隨機數(shù)字表法分為6組，即空白組、模型組、偏治顆粒低劑量組(5.4 g生藥/kg)、偏治顆粒中劑量組(10.8 g生藥/kg)、偏治顆粒高劑量組(20.16 g生藥/kg)及對照組(琥珀酸舒馬普坦片18 mg/kg)，每組10只。

1.2.2 造模 偏治顆粒低、中、高劑量組及對照組分別予相應(yīng)的藥物預(yù)防給藥7 d，每日1次灌胃，給藥容積為10 mL/kg，空白組、模型組均予等容積蒸餾水。末次灌胃1 h后，除空白組外，其余5組大鼠均皮下注射硝酸甘油10 mg/kg，制備偏頭痛大鼠模型[6-7]，各組大鼠出現(xiàn)耳紅為造模成功。

1.3 取材方法 各組大鼠按照3 mL/kg腹腔注射10%水合氯醛溶液，麻醉后將大鼠仰臥位固定于操作臺，開胸暴露心臟，將灌注針刺入左心室，右心耳剪孔，使用0.9%氯化鈉注射液200 mL沖洗至肝臟變白，然后用4%多聚甲醛固定液(0.01 mol/L PBS配制，pH 7.4)200 mL為灌流固定，直至身體僵硬震顫為止[8-9]。斷頭、開顱取全腦，分離出三叉神經(jīng)脊束核，置于4%多聚甲醛固定液中固定24 h。固定后的三叉神經(jīng)脊束核用酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片備用。

1.4 觀察指標(biāo)及方法

1.4.1 各組大鼠耳紅出現(xiàn)及消失時間 對造模后各組大鼠耳紅出現(xiàn)及消失時間進(jìn)行觀察。

1.4.2 大鼠三叉神經(jīng)脊束核神經(jīng)元免疫組化CGRP-1和P物質(zhì)表達(dá)的積分光密度值(IOD)檢測 免疫組化染色方法為SP法：石蠟切片，60 ℃恒溫加熱3 h，常規(guī)脫蠟至水。內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑孵育10 min。蒸餾水沖洗1次，于PBS中浸泡5 min。放入pH 7.0的檸檬酸鹽緩沖液中高壓修復(fù)5 min[10]。室溫自然冷卻，血清封閉15 min后去除血清封閉液。滴加經(jīng)PBS稀釋的一抗(CGRP-1 1∶150，P物質(zhì)1∶200)，37 ℃孵育2 h。使用PBS沖洗5次，每次3 min。滴加生物素標(biāo)記的二抗(兔抗鼠)，37 ℃孵育1 h，PBS沖洗5次，每次3 min。然后滴加鏈霉親和素-過氧化物酶,37 ℃孵育30 min。PBS沖洗5次，每次3 min。滴加DAB顯色劑，自來水充分沖洗后，蘇木素染液復(fù)染，中性樹膠封片[11]。使用光學(xué)顯微鏡于200倍鏡下觀察免疫組化染色切片，采用ImageJ軟件對免疫組化圖片進(jìn)行灰度值分析，計算各組大鼠IOD。IOD=log[gv0/gv)]，gv0為背景灰度值，gv為目標(biāo)區(qū)灰度值[12]?？贵w表達(dá)越強，IOD越大，對應(yīng)的圖片染色越深。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠耳紅出現(xiàn)及消失時間比較 見表1。

組 別n耳紅出現(xiàn)時間耳紅消失時間空白組10--模型組103.24±0.57157.23±14.28偏治顆粒低劑量組103.57±0.72150.52±14.33偏治顆粒中劑量組104.26±0.75?141.37±13.23?偏治顆粒高劑量組104.61±0.81?132.48±13.38?對照組104.73±0.85?127.41±12.26?

與模型組比較，*P<0.05

由表1可見，偏治顆粒中、高劑量組及對照組大鼠耳紅出現(xiàn)時間較模型組增加(P<0.05)，耳紅消失時間較模型組縮短(P<0.05)。偏治顆粒中、高劑量組與對照組組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組大鼠三叉神經(jīng)脊束核神經(jīng)元CGRP-1和P物質(zhì)表達(dá)的IOD比較 見表2。

組 別nCGRP-1P物質(zhì)空白組100.024±0.0150.065±0.011模型組100.463±0.138?0.237±0.062?偏治顆粒低劑量組100.418±0.1520.201±0.058偏治顆粒中劑量組100.332±0.103△0.179±0.052偏治顆粒高劑量組100.235±0.096△0.124±0.044△對照組100.187±0.087△0.137±0.041△

與空白組比較,*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

由表2可見，模型組大鼠CGRP-1和P物質(zhì)表達(dá)的IOD均高于空白組(P<0.05)。偏治顆粒中、高劑量組及對照組CGRP-1表達(dá)的IOD均低于模型組(P<0.05)，偏治顆粒中、高劑量組與對照組組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。偏治顆粒高劑量組及對照組P物質(zhì)表達(dá)的IOD均低于模型組(P<0.05)，偏治顆粒高劑量組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。免疫組化染色后各組大鼠三叉神經(jīng)脊束核神經(jīng)元CGRP-1和P物質(zhì)表達(dá)見封2，圖1、2。

3 討 論

偏頭痛為發(fā)作性的顱內(nèi)和顱外血管功能障礙，以反復(fù)發(fā)作的頭痛為特征[13]。偏頭痛的病因尚不明確，女性偏頭痛傾向于月經(jīng)來潮前發(fā)作，提示發(fā)病可能與內(nèi)分泌或水鈉潴留有關(guān)。精神緊張、強光刺激、低血糖、應(yīng)用擴血管藥物或食用高酪胺食物、酒精類飲料，均可誘發(fā)偏頭痛發(fā)作。各種誘因引發(fā)偏頭痛大體可分為血管源學(xué)說和神經(jīng)源學(xué)說。典型偏頭痛先有顱內(nèi)動脈收縮，局部腦血流減少，引起視覺改變、感覺異?；蜉p偏癱等先兆癥狀，繼而顱內(nèi)、顱外動脈擴張，出現(xiàn)頭痛。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，偏頭痛主要是在感受風(fēng)邪、情志內(nèi)傷、飲食不節(jié)、憂思勞累、久病致瘀的基礎(chǔ)上，造成肝、脾、腎等臟腑功能失調(diào)，風(fēng)襲腦絡(luò)，風(fēng)陽內(nèi)動，痰火阻滯所致。治宜平肝熄風(fēng)，化痰清熱。偏治顆粒中白芍為君藥，養(yǎng)血斂陰，柔肝止痛；白術(shù)、當(dāng)歸、茯苓為臣藥，燥濕健脾，補血益氣；柴胡、半夏、芥子為佐藥，疏肝升陽，燥濕化痰；甘草為使藥，緩急止痛，調(diào)和諸藥。中藥治療偏頭痛的機制主要在于抑制二磷酸腺苷(ADP)誘導(dǎo)的血小板聚集，降低腦內(nèi)血清素含量，達(dá)到解痙、止痛作用[13]。本研究中偏治顆粒中、高劑量組大鼠耳紅出現(xiàn)時間增加(P<0.05)，說明偏治顆粒具有延緩硝酸甘油誘發(fā)偏頭痛大鼠頭部血管擴張的作用。偏治顆粒中、高劑量組耳紅消失時間縮短(P<0.05)，說明偏治顆?？煽s短硝酸甘油誘發(fā)偏頭痛大鼠頭部血管擴張時間。

CGRP是已知最強的擴血管物質(zhì)，具有降低外周阻力、舒張腎動脈、增加腎血流量的作用[14]。CGRP可舒張冠狀動脈，用于治療冠狀動脈粥樣硬化，其舒張血管的作用不依賴于血管內(nèi)皮的存在，說明CGRP可有選擇地結(jié)合降鈣素受體。CGRP對所有血管均有明顯舒張作用，其作用較乙酰膽堿等物質(zhì)強。CGRP是廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)的一種神經(jīng)肽，其在外周及脊髓參與傷害性信息的傳遞及痛敏化的形成，并與P物質(zhì)、辣椒素1型受體、阿片受體、神經(jīng)生長因子、5-羥色胺、糖皮質(zhì)激素等生物活性物質(zhì)在痛覺調(diào)制過程中相互影響[15]。偏頭痛患者可檢測到由三叉神經(jīng)所釋放的CGRP，三叉神經(jīng)分布于涉痛區(qū)域，偏頭痛可能就是一種神經(jīng)源性炎癥。還有一種解釋是小腦動脈和大腦后動脈腫脹造成的第Ⅲ對腦神經(jīng)的損害，也可能為神經(jīng)的炎癥[5]。本研究中偏治顆粒中、高劑量可降低大鼠三叉神經(jīng)脊束核神經(jīng)元CGRP-1的表達(dá)，因而產(chǎn)生減輕神經(jīng)血管性炎癥性頭痛的作用。

P物質(zhì)是分布于神經(jīng)纖維內(nèi)的一種神經(jīng)肽，也被稱為速激肽。當(dāng)神經(jīng)元受刺激后，P物質(zhì)可在中樞和外周神經(jīng)末梢釋放，與速激肽1受體(NK1)結(jié)合發(fā)揮生理作用[16]。在中樞末梢釋放的P物質(zhì)與痛覺傳遞相關(guān)，能直接通過促進(jìn)谷氨酸的釋放參與痛覺傳遞。逆向電刺激感覺神經(jīng)或經(jīng)細(xì)傳入纖維傳出的軸突反射可使外周端末梢釋放P物質(zhì)，引起該神經(jīng)支配區(qū)血管擴張、通透性增加等神經(jīng)源性炎性反應(yīng)[17]。因此，P物質(zhì)的主要功能是傳遞痛覺信息，外周傷害性感覺經(jīng)傳入纖維傳至腦干，釋放P物質(zhì)，激活二級傷害感受神經(jīng)元，向腦內(nèi)痛覺中樞傳遞痛覺信息。偏治顆粒高劑量組可降低大鼠三叉神經(jīng)脊束核神經(jīng)元P物質(zhì)表達(dá)，起到阻斷P物質(zhì)引起神經(jīng)源性炎性反應(yīng)的作用。

綜上所述，偏治顆?？赏ㄟ^調(diào)節(jié)CGRP-1和P物質(zhì)在三叉神經(jīng)脊束核神經(jīng)元中的表達(dá)對偏頭痛大鼠模型產(chǎn)生保護(hù)作用，為偏治顆粒臨床治療偏頭痛提供了實驗依據(jù)。