石彩歌 黃士荷 張素粉 肖奇志 陳 興 王群慧 郭天棋

1.廣東省珠海市婦幼保健院婦科，廣東珠海 519001；2.廣東省珠海市婦幼保健院檢驗科，廣東珠海 519001

研究表明，約99%的宮頸癌患者是由人類乳頭瘤病毒（HPV）感染所致，這種病毒能夠通過密切接觸和性接觸傳播，并且能被人體長期攜帶[1]。雖然大多數(shù)高危型人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染是一過性的，可被機體免疫系統(tǒng)清除，但仍有少部分婦女存在高危型HPV 持續(xù)感染，進而導致宮頸上皮細胞病變[2-3]。因此，有效的人體免疫體系對清除HPV 感染意義重大。本研究擬將TNF-β 的候選SNP rs909253、rs2239704和IFN-α 的候選SNP rs6475526 多態(tài)性作為宮頸病變分子分型指標，為不同分期的宮頸病變自然轉(zhuǎn)歸提供基因分型的基礎數(shù)據(jù)，對臨床治療和管理具有一定的指導意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收 集 本 院2018 年1 月～2019 年6 月 高 危型HPV 陽性病例共236 例，年齡22 ～63 歲，平均（42.5±10.3）歲，根據(jù)病理確診CIN 級別分為病理正常組、CIN Ⅰ組、CIN Ⅱ組、CIN Ⅲ組以及宮頸癌組，每組分別45、48、47、50、46 例。納入標準：（1）所選患者均因白帶異常、陰道流血、接觸性出血、宮頸炎等癥狀出現(xiàn)而就診；（2）所有病例均有性生活史，就診前一周內(nèi)未行陰道藥物治療。排除標準：經(jīng)病理或細胞學確診為子宮炎癥、良性病變、繼發(fā)腫瘤及病情危重不能清晰回答問題者。以高危型HPV-DNA 檢測陰性和病理組織細胞學檢測陰性的健康女性為對照組，年齡23 ～60 歲，平均（40.3±8.3）歲，排除妊娠期、宮頸上皮內(nèi)瘤變病史、腫瘤病史及盆腔放射史，共收集56 例標本。各組一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集 （1）宮頸脫落細胞高危型HPV感染狀態(tài)的檢測按臨床常規(guī)檢測進行：取材自宮頸脫落細胞，細胞保存液4℃保存，一周內(nèi)檢測并記錄結(jié)果。宮頸組織細胞病理檢查按常規(guī)送病理科檢測，登記檢測結(jié)果。（2）真空采血管收集病例組及對照組受試者靜脈血3mL，采用乙二胺四乙酸（EDTA-K2）抗凝，取其中的200μL，采用全血核酸提取試劑盒提取檢測對象外周血基因組DNA，于-20℃冰箱內(nèi)保存，剩余血液樣本凍存于-20℃。

1.2.2 檢測方法 （1）高危型HPV-DNA 檢測：選擇亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司檢測HPV-DNA 23 型試劑盒，按說明書提取DNA，依照程序進程基因擴增，產(chǎn)物變性，并采用全自動雜交儀進行雜交，肉眼觀察結(jié)果。（2）宮頸組織細胞學檢測由臨床醫(yī)生陰道鏡下取樣，送病理科檢測并出具報告。（3）引物設計：針對TNF-β 的候選SNP rs909253、rs2239704 和IFN-a 的 候 選SNP rs6475526，從Genebank 查找SNP 所在人基因組序列，并用prime 5.0 設計擴增和測序引物。由生物公司合成引物。（4）TNF-β、IFN-α 基因候選SNP 檢測摸索優(yōu)化條件應用PCR 方法擴增TNF-β、IFN-α 基因候選SNP 靶片段，采用Sanger 測序法對PCR 產(chǎn)物進行測序，確定SNP 等位基因型。

1.3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)采用SPSS22.0 統(tǒng)計分析軟件進行處理及統(tǒng)計分析，首先檢驗基因型頻率分布是否符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律的要求，基因型和等位基因頻數(shù)的分布差異采用χ2檢驗，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組TNF-β（rs909253）基因型及等位基因頻率分布比較

與病理正常組及對照組比較，CIN Ⅰ組、CIN Ⅱ組、CIN Ⅲ組以及宮頸癌組TNF-β（rs909253）基因型分布頻率和等位基因分布頻率差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），見表1 ～ 2。

表1 各組TNF-β（rs909253）基因型頻率分布比較[n（%）]

表2 各組TNF-β（rs909253）等位基因頻率分布比較[n（%）]

2.2 各組TNF-β（rs2239704）基因型及等位基因頻率分布比較

與病理正常組及對照組比較，CIN Ⅰ組、CIN Ⅱ組、CIN Ⅲ組以及宮頸癌組TNF-β（rs2239704）基因型分布頻率和等位基因分布頻率差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），見表3 ～ 4。

表3 各組TNF-β（rs2239704）基因型分布比較[n（%）]

表4 各組TNF-β（rs2239704）等位基因頻率分布比較[n（%）]

2.3 各組IFN-α（rs6475526）基因型及等位基因頻率分布比較

與病理正常組及對照組比較，CIN Ⅰ組、CIN Ⅱ組、CIN Ⅲ組以及宮頸癌組IFN-a（rs6475526）基因型分布頻率和等位基因分布頻率差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），見表5 ～ 6。

2.4 TNF-β、IFN-α基因與宮頸HPV感染持續(xù)及復發(fā)的關(guān)系

病例組236 例患者中9 例失訪，平均隨訪時間8個月，發(fā)現(xiàn)HPV 再次檢出率為57.20%（135/236），HPV陰性后再次陽性率為23.70%（32/135），經(jīng)Kaplan-Meier 法分析并繪制曲線后，隨訪期間CC、CT、TT基因型的累計HPV 陰性率有明顯差異（P ＜0.05），其中CC基因型攜帶者的HPV感染的累積陰性率最低，且該型攜帶者的預后更差，復發(fā)率更高。

表5 各組IFN-α（rs6475526）基因型頻率分布比較[n（%）]

表6 各組IFN-α（rs6475526）等位基因頻率分布比較[n（%）]

3 討論

高危型HPV 持續(xù)感染是宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌的主要病因。宮頸癌給個人、家庭帶來極大影響，而宮頸疾病的過度治療也給社會造成了巨大的經(jīng)濟損失，且這種情況有明顯的上升趨勢[4]。為加強宮頸高危型HPV 相關(guān)疾病的防治工作，國家對于“兩癌”的篩查就包括宮頸癌[5]，這將對婦女健康生活質(zhì)量的提高、社會經(jīng)濟的發(fā)展有重要意義。此外，宮頸癌患者臨床特征、平均住院日、快速增長的手術(shù)費及居高不下的藥費是造成高額住院費用的主要因素[6]。因此，控制HPV 感染的轉(zhuǎn)歸，對降低宮頸上皮內(nèi)瘤變進展為宮頸癌、減少宮頸癌發(fā)病機會均有較大社會及經(jīng)濟效益[7]。

研究認為[8-9]，HPV 雖是誘發(fā)宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變的重要病原體，但僅有少數(shù)的HPV 感染者最終罹患宮頸癌，其余呈HPV 病毒攜帶狀態(tài)，部分發(fā)展成為宮頸上皮內(nèi)瘤變，說明HPV 感染后自然結(jié)局在個體之間存在著非常大的差異。TNF-β是一種細胞毒性蛋白，主要由活化的T 細胞產(chǎn)生，是細胞免疫的重要因子，同時在先天免疫調(diào)節(jié)方面也發(fā)揮重要作用，能夠抑制腫瘤生長和破壞癌細胞[10]。TNF-β 的轉(zhuǎn)錄表達也受基因多態(tài)性的影響，有研究表明rs909253 和rs2239704 組成的SNPs單倍體可增加非何杰金淋巴瘤發(fā)生危險。IFN-α屬于Ⅰ型干擾素，是調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的一類細胞因子，主要參與先天免疫反應和抗病毒感染， HPV 感染亦與IFN-α 的表達相關(guān)。有報道rs6475526 基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌的預后相關(guān)[11]，可以作為獨立的生物標記物評估風險，國外學者報道認為[12]，在印度女性中TNF-β 基因rs909253 位點多態(tài)性與宮頸癌的不良預后相關(guān)，并可能是由于CC 基因型關(guān)聯(lián)的TNF-β 基因低表達所導致。與此相對的是在南非女性的研究中rs909253 位點多態(tài)性與宮頸癌并無明顯關(guān)聯(lián)。其它研究表明仍需要進行更大樣本量的前瞻性研究或相匹配的病例對照研究來進一步明確是否IFN-a 基因rs6475526 位點多態(tài)性與宮頸HPV 感染風險相關(guān)，減少偏倚，并進一步明確IFN-a 基因rs6475526 位點多態(tài)性是否與單一亞型的HPV 感染風險相關(guān)[13]。通過收集高危型HPV陽性病例，根據(jù)病理確診CIN 級別分為不同組別，與體檢HPV 和病理細胞學雙陰人員樣本進行對照，運用PCR 擴增和Sanger 測序法檢測各組基因多態(tài)性，結(jié)果顯示：各組別與對照組比較，rs909253、rs2239704、rs6475526 基因型分布頻率和等位基因分布頻率存在明顯差異。CC 基因型攜帶者的HPV感染的累積陰性率最低，且該型攜帶者的預后更差，復發(fā)率更高，更容易在高級宮頸疾病組出現(xiàn)。因此，推斷TNF-β、IFN-α 基因在HPV 相關(guān)子宮頸癌及宮頸病變發(fā)生及進展中可能起到一定的作用。TNF-β 基因rs909253、rs2239704 等位基因可能通過影響宮頸局部的免疫狀態(tài)進而影響了HPV 感染后的轉(zhuǎn)歸，導致HPV 感染持續(xù)化，細胞和組織進一步向?qū)m頸內(nèi)瘤樣變發(fā)展，增加了宮頸癌的危險性。且CC基因型攜帶者更傾向于HPV 感染的持續(xù)和復發(fā)[14-15]。持續(xù)追蹤研究病例，記錄宮頸疾病的進行性變化和后續(xù)結(jié)局，將對本研究有非常有益的補充作用。

綜上所述，可將TNF-β、IFN-α 基因多態(tài)性作為宮頸病變分子分型指標，尤其是建立TNF-β 的候 選SNP rs909253、rs2239704 和IFN-α 的 候 選SNP rs6475526 的PCR 基因擴增+Sanger（第一代）測序檢測方法，能夠準確識別并判讀SNP 的類型，從而有目的控制HPV 感染的轉(zhuǎn)歸，降低宮頸上皮內(nèi)瘤變進展，為腫瘤的精準預防與控制提供依據(jù)。